第二章 微生物的纯培养

微生物学第二章微生物的纯培养和显微技术基本概念1、微生物的纯种分离：将多种混杂的微生物，经某种技术或 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 分离或纯化的过程。2、微生物的培养物（culture)：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。纯培养物（pureculture)：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。3、菌落（colony):分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见、有一定形态结构的子细胞生长群体。当固体培养基表面众多菌落连成一片时便成为菌苔。4、培养平板（cultureplate):冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中所形成的培养基固体平面，简称平板，是用于微生物纯培养的最常用的固体培养基形式。第一节微生物的分离和纯培养无菌技术（aseptictechnique）在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。它是保证微生物学研究正常进行的关键。一、无菌技术的定义和意义1.微生物培养的常用器具3.操作环境4.操作过程必备无菌操作箱接种环境消毒灭菌酒精棉球消毒双手开启的管口、瓶口靠近灯焰拔出的棉塞勿触及任何地方动作快，接种时间勿太长要点必备纠错使用过的废液可以直接倒在水槽中将食物和饮料带入 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 内做完实验未洗手就离开棉塞随意丢在桌上哪个正确？谁的操作比较规范？二、用固体培养基获得纯培养适用于大多数细菌、酵母菌以及许多真菌和单细胞藻类。1、涂布平板法（SpreadPlatemethod）2、稀释倒平板法3、平板划线法（StreakPlate）4、稀释摇管法（厌氧培养法）1、涂布平板法（SpreadPlatemethod）特点：简单易行，但易造成机械损伤 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 ：制板稀释加菌液涂布培养挑菌落2、稀释倒平板法步骤：稀释加菌液浇培养基培养挑菌落稀释样品的取样和倾注平皿每个稀释度做两个平皿将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。1.取样倾注平皿1：10稀释液225mL无菌水1mL1mL9mL稀释液1：1009mL稀释液1：10001mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1ml无菌水25g或25ml检样3、平板划线法（StreakPlate）特点：快速、方便。步骤：制板接种环灭菌挑菌落/菌液划线培养挑菌落4、稀释摇管法（厌氧培养法）用于厌氧菌的培养灭菌石蜡和固体石蜡密封将待分离的样品进行连续稀释得到高度稀释的效果,如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.三、用液体培养基获得纯培养四、单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。适应于高度专业化的科学研究五、选择培养为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。1、利用选择培养基进行直接分离2、富集培养1、选择平板培养根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有一定特征，然后挑取单菌落。分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上分离。分离蛋白酶产生菌，可在培养基中加入牛奶或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透明的蛋白质水解圈。2、富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后再进行培养。保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。基本要求：用于长期保藏的原始菌种称为保藏菌种或原种（stochculture）。六、微生物的保藏技术菌种保藏的原理首先，要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体进行保藏。其次，创造一个使微生物代谢不活泼、生长受抑制的环境条件（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）。再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。菌种保藏的方法一种良好的菌种保藏方法保持原菌的优良性状长期稳定方法的通用性操作的简便性设备的普及性优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。缺点：时间短、传代多、易退化。低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件，一般4～6个月必须传代一次。①斜面低温保藏法方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。1、传代培养保藏方法②石蜡油低温保藏法：操作方法：生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡，液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。原理：在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。优点：保藏时间1～2年，方便，除石油发酵微生物外，各类微生物均可。缺点：时间短、传代多、易退化。衰退1.定义衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而是某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。菌种的衰退是发生在微生物细胞群中的一个由量变到质变的逐步演化过程。菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种退化，这种变异也称负变（minusmutation）。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡；例如，微生物菌落形态或个体形态的变化；生长速度缓慢，产孢子量减少；色素产生情况的变化；研究菌种遗传标记的丢失，生产菌种生产性状的劣化等。2.衰退的原因造成菌种退化的主要原因是基因突变。误区生产工艺条件控制不当杂菌污染造成生产性能下降饰变3.衰退的防止（1）选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株经诱变等处理后的菌种要连续传代、分离纯化，防止分离回复。（2）控制传代次数尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的几率。（3）创造良好的培养条件创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退；例如，给予营养缺陷型适当的营养必需成分，可降低回复突变频率。（4）利用不同类型的细胞进行接种传代放线菌和霉菌一般用单核的孢子接种的，菌丝细胞常含有几个细胞核，甚至是由异核体组成的，用于接种就易出现离异（dissociation）或衰退。例如，构巢曲霉如用分生孢子接种易退化；如用子囊孢子接种则不易退化。（5）采用有效的菌种保藏方法菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂（甘油、二甲亚枫、血清蛋白、脱脂牛奶等）中，预冻后保存在液氮中（-196℃）或低温冰箱（-70℃）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。优点：保藏效果好。缺点：价格昂贵低，温度对细胞有损伤。2、冷冻保藏——低于－70℃冷冻真空保藏法操作方法：是将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态下升华其中水分，最后达到干燥、缺氧、低温的状态。培养物用保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷冻、抽真空、封口。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。3、干燥保藏法优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构大都使用此法保藏。缺点：不能保藏真菌菌丝。干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 上保藏。如砂土管保藏法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4℃保藏各种微生物的短期保藏。1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温或4℃保藏各种微生物的中短期保藏，不适用某些能分解烃类的菌种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器中抽真空，室温或4℃保藏产孢子微生物和芽孢细菌的长期保藏，不适用对干燥敏感的微生物1-10年麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4℃保藏产孢子霉菌和某些放线菌，工厂多采用此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中，需低温冰箱基因工程菌1年/10年冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快速冻结，减压抽真空，需冻干机各类微生物5-15年液氮超低温保藏法保护剂，超低温（-196℃），需超低温液氮设备各类微生物15年以上宿主保藏法与培养基混合直接低温保存专性活细胞寄生微生物（如病毒）几种常用菌种保藏方法的比较菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）国内外菌种保藏机构：任务：广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株（有时还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等），并将它们妥善保藏，使之不死、不衰、不乱，便于研究、交换和使用。国家设立专门的菌种保藏机构思考题1、用固体培养基分离纯培养的方法有哪些，如何操作？2、菌种保藏的方法有哪几种，各自的优缺点是什么。ThankYouforYourAttention!