凋亡相关基因一Bax在不同细胞中
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达产物差异检测江一舟06级临八1班063010101931实验目的1-1通过测定凋亡相关基因-Bm在不同细胞中表达产物差异检测，硏究缺糖对细胞增殖抑制作用的机制（引起细胞疲亡或坏死〉。1・2寧握免疫组织化学法的原理。2实验原］21免疫细胞化学和亲和组织化学免疫细胞化学（免疫组化）將抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示.从而対细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。亲和组织化学则将一些具有双价或多价结合力的物质（生物素），应用于免疫组化.更得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵馭性和高持异性°2.2凋亡相关基因一BaxBax是Bd-2家族成员°凋亡信号能激活Bax,使Bax蛋白从胞浆移位到线粒体膜上°鴉后其蛋白构象发生改变（寡娶化）.使线粒体膜通透性谱加.释KQic.引起细胞凋亡。3.3B狀表达产物差异检测本次实验^Bax构象蛋白為抗凉.用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合.再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合.形成了生物素复合物。此复台物与SABC作用.使得检测物被放大.最后在显色剂DAB的作用下.Bax构象蛋白显色（遏色h3实验材斜仪器：移液枪.枪头、滴管、显微镜。材料：培养细胞。试剂：甲醛、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB.0.3%H2O2-PBSo4实验步骤25yl,37'Cf培养细胞（96孔板.每组3正常、3损伤、3损伤恢复）一PBS洗.5minX3次（轻轻地洗涤）一甲醇固定lOmin—PBS洗,5ininX3次一加入封闭液（1:10）30min一加一抗（1:300）2冲1.37C,lh一PBS洗.5minX3^一加二抗25g37匕,lh—PBS洗,5minX3次一加03%H2O2-PBSt37C,30min—PBS洗.5minX3次一SABCT作液2O・30g37C,lh-PBS洗.X3次一DAB显色•观察结果口5实验结果正常组的细舸形态饱满•胞质透明，基本不着色•核形态规则，为圆形或欄圆形。損伤组中.部分细抱呈现典型凋亡细抱形态・细胞变圆、皱缩.胞质深染•核质比例增天；其余细胞胞质着色较正常组深。損伤恢变组中.少部分细胞呈现典型凋亡细胞形态.细胞变圆、皱缩•胞质深染•核质比例增大；具余细胞胞质着色较正常组深。免疫组化显示.Bax构象蛋白在正常组细胞中几乎没有表达.而在摄伤组和损伤恢复组中均有表达，其中损伤恢复组的B段构显蛋白表达量高于损伤组（图5B免疫细胞化学法检测Bax蛋R的表达A：正常组&9CHL细胞;B：扌员伤组的CHL细胞；C：损伤恢簸组的CHL细胞6讨论61Bax可以被凋亡信号激活.从犯浆移位到线粒体模上.随后其蛋白构象发生改变（寡聚化）.使线粒体模通透性增加*释放Cycc.引起细胞凋亡"展进凋亡的机理主要是;①线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和ATP的合成功能被破坏；②细胞氧化还原作用改变;（WW中时周亡相关Apaf-1释放出来.与细胞色素C相互作用.激活Caspase信号转导途径。助x构象蛋白含量可以作为评价细胞凋亡的指标。不实验用免疫组化法检测了正常组、损伤组.损伤恢复组的Bax构隸蛋白表达变化,结果显示.Bax构象蛋白阳性表达量：损伤组〉撮伤恢复组〉正常组。由此可知.①缺糖对CHL细胞增殖的抑制作用是通过促逬细胞凋亡实现的；②细胞凋亡程度；损伤组二损伤恢复组》正常组。$2本实验中.损伤组细胞的Bax蛋白表达量高于损伤恢复组，原因可能是损伤时间（5h）不长，线粒体和细胞廡的正常功能禾完全釆失，犍的重新加入一方庖为细舸提供了能量来源十启一方面可以增强细胞质和线粒体内的应激蛋白（如gip75）的表达•而gip?5的上调義达可以起到保护蛋白质，协助蛋匕（特别是线粒体蛋白｝转运，提高细胞对应滋反应耐受性的作用.从而延缰细胞凋亡a当缺犍旳间过长时，由于线粒体和细胞膜的正常功能已基本丧失，犍的重新加入可能不会延缓细胞的凋亡进程.甚至可能通过引起ROS的升高.造成缺精恢复组的凋亡程度高于缺糖组(d以设计实验进行探索)。63正常组中.细胞密度较高区域的细胞呈现B狀构象蛋白高表达.原因可能是接种细胞过多以致部分区域细胞发生凋亡。LTJ6.4几种试剂的作用641封闭液可以封闲非特异性位点.从而保证抗原抗体间的特异性结台。64203%HzOz-PBS(甲醇)可以消除内源性过氧化物骑活性f乍用•从而消除其刘SABC-DAB显鱼的影响°643SABC是链酶亲和素——生物素——过氧化物酶复合.起到信号放大作用°6.5检测细胞凋亡的其他方法凋亡相关蛋白(Bax.Bcl-2.Caspase-3.8.9等)表达变化的检测除了用免疫组化法外.还可以Westernblot除此以外，还可以利用透射电镜，荧光显微镜、DNAladder.流式细胞仪检测细舸凋亡□6.6后续买验设计本实验检测到了Bax构象蛋白在损伤组和抚伤恢痘组细胞中的表达.可以设计后续实验.胡究缺糖诱导细胞凋亡的信号通路-核转录因子kB(nuclearfactor-kB.NF-kB)是普遍存在于细胞浆中的一种丿I賑应转录因子.是由芮()和p65(Rel-A)两个亚单位构成的异源二聚体.p50是与DNA结合的部分.p65是与抑制蛋白IxB(InhibitorsofKappaB)结台的部分。众參研究结果指出•核转录因子NF-M在抑制细胞凋亡中起到重芟作用。NF十B有多种功能，其一就是增gBcl-2表达和抑制Bax表达°Bax/Bcl-2比值的升高可以激活Caspase-3.而Caspase-3是细胞凋亡的执行者，它可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡C缺精诱导CHL细胞凋亡的机制可能与抑制核约录因子NF・KB活化•导致Bax/Bck2比(S的上调.继而激活Caspasc-3有応故可用Westernblot法检测凋亡前后NF・kB(p65)和Bcl-2.Bax.Caspase-3的表达变化.从而验证上述假设口
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