课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段自学提纲：知识回顾：1.DNA分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；2.DNA复制过程和特点；3.PCR技术概念及应用。基本概念：变性、复性、TaqDNA聚合酶、引物理解PCR技术的原理掌握PCR技术的全过程比较PCR技术和体内DNA复制的异同点。1、DNA分子的3’端与5’端-OH端为3’;磷酸基团的末端为5’。2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链
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合成子链原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸思考：3、体内DNA复制的条件是什么？体外扩增DNA如何提供相似环境？变性（80-100℃）Taq聚合酶（耐高温）15—30个核苷酸构成DNA或RNADNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）4、DNA分子的热变性原理：变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合一、PCR技术的原理利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5’端向3’端延伸。二、PCR的反应过程每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。三、实验步骤：准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心10分钟将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应注意事项：详见操作提示四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算（公式见P63）波长260nm处读数蒸馏水做对照50倍PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A反复洗涤B不怕外源DNA污染C高压灭菌D在—20℃储存
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