水稻中引入两细胞C4光合途径的方法

12-水稻中引入两细胞C4光合途径的方法上官欣欣2011202040096摘要：每天大约有十亿人遭受长期的饥饿，并且这种局面很可能恶化，到2050年估计要增长到90万。为了给将来提供充足的营养，亚洲水稻的产量需要增加60%，这一变化可能需要往水稻里引入C4光合循环。国际C4水稻协会的成立就是为了验证往水稻中引入C4循环的可行性。本文提供了C4水稻协会所使用的许多方法中的两种的升级，即：代谢C4 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 和通过突变筛选确定叶片结构的决定因素。代谢C4工程的目的是用合适的方法在水稻中 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达C4循环中的典型酶NADO-ME,从而形成C4循环。它还有另外一个目的，就像C4植物中的那样，通过下调叶肉细胞中RuBisCO和甘氨酸脱羧酶的表达，从而限制维管束鞘细胞中RuBisCO和甘氨酸脱羧酶的表达。除了生化方面的变化，C4物种在叶片结构方面比较紧凑，包括增加叶脉密度，减少叶脉之间叶肉细胞的数量。通过对水稻激活标记的植株和丧失功能突变植物的筛选，我们努力找到控制这些关键特点的基因。关键词：激活标记植株，C4工程，C4光合作用，玉米，代谢工程，突变筛选，水稻，转化。简介：水稻为世界人口提供了大量的热量。到2050年如果全球人数增长到90万，我们需要大量增加水稻的产量。当前，大约有9.25亿人口遭受长期的饥饿，并且每天大概有1.44万的孩子死于饥饿。亚洲人数的增长需要水稻产量提高60%，也就是说现在每公顷水稻可以喂养27个人，但将来就要养活43个人。另外一些限制也会存在于农业和土地的利用方面，比如说气候变化，水的减少，能量的可利用率以及生物燃料的要求也会对水稻的产量增加限制。直到最近，人们意识到水稻产量应该和人口增长相适应，但是培养矮品种的水稻以提高产量这种方法似乎已经达到极限。为了提高水稻产量的被称作的第二次绿色革命，将会大量提高水稻产量。当前的育种方法会提高水稻产量，并且培育出耐旱、耐盐的品种使我们更好的利用边缘土地。然而这些方法似乎不可能到2050年将水稻产量提高60%。模型和实验分析表明，水稻最大产量决定于水稻生长季节的过程中大量的光反应，光能利用效率和收获指数。在绿色革命中收获指数和有效光合辐射的获得量大量增加。产量可以通过延长生长时间来实现，perunittimethisdoesnotincreasetheamountofdrymatterharvested.水稻的有效光合辐射的量只会通过增加水稻在阳光充足的气候中来改变。总之，绿色革命，改变光能利用率（RUE）很可能在水稻产量上获得大量增加。幸运的，C4光合作用的进化提供了一个生物先例，表明C3植物的RUE可以增加。C4植物，比如玉米，高粱，甘蔗比C3植物如水稻，小麦，马铃薯等的RUE高50%，向水稻中引入C4光合作用能够增加50%的RUE以及产量，同样的也很有可能会提高氮和水的利用效率。为了 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 向水稻中引入C4循环的可行性，国际水稻研究所在2008年成立了由24个参与研究群体组成了国际C4水稻协会。在这个群体中参与者包括从系统生物学，生理表型，深度测序，到代谢工程和Kranz解剖学的水稻突变体的筛选。总之，这些互补的方法应该可以增加我们对C4途径的理解，并且促成向C3植物中转入C4途径。很明显，另外的方法比如修饰现存的，促成新的代谢途径，这些都可以增加RUE。为了引入这些工作，我对地球上大多数C4植物的C4途径是怎样的进行了简单的总结，以及一些检测将C4途径引入水稻的可行性的策略。卡尔文本森循环中的中心酶，RuBisCO，不仅催化C02的固定，也催化02的固定。RuBisCO的加氧酶的活性产生一种毒性的代谢产物，磷酸乙醇酸，打破了被称为光呼吸的能量消耗反应。羧基化与氧合作用的比率决定于C02与02的溶解量之比，并且这个比率会随着温度升高而降低。因此，C3光合作用在较高的温度下变得更加耗能，并且引起RUE的降低。C4光合循环能够增加光合作用是通过在RuBisCO周围聚集C02,从而大量降低加氧酶的反应。尽管C4途径每固定一个C02,需要多消耗2个ATP,但由于加氧反应依赖温度，它比C3光合作用在叶片温度在20-25°C时能量需求低，使C4植物在水稻种植的地方更高产。发现的C4循环已经被引进到高产的植株中行驶两个细胞间的C4系统，也就是叶肉细胞和鞘细胞围绕着维管束被称为花环结构。C4循环的生化反应在空间上分别在这两种不同细胞中，以及编码这些蛋白的C4基因在叶肉细胞或鞘细胞特异的方式表达。C4循环的第一步发生在叶肉细胞中，在PEPC的催化下，碳酸氢盐和PEP固定起始碳原子，形成四碳组分0AA。然后0AA和苹果酸或天冬氨酸相互作用，形成C4化合物进入鞘细胞，然后脱羧反应增加鞘细胞中C02的聚集，并且RuBisC0受到抑制。最后，C4循环的起始底物，PEP，通过丙酮酸和PPDK又在叶肉细胞中重新形成。另外，除了光合作用中生化反应和叶片的发育的不同，C4叶片在细胞生物学上也有不同，比如组织的结构。考虑到多层面的复杂性，C4光合作用至少经历了19个家族62次的进化，表明这是收敛性进化的一个最标志性的例子。C4循环的产生向水稻中引入多种性状如C4光合作用毫无疑问是一个巨大的挑战。然而，接受这个挑战最大的原因是大量的增加RUE。另外，有大量的生物因素暗示C4光合作用的进化可能不像刚开始出现的那样难。第一，C4光合作用进化了很多次表明C3植物可能在某种条件下具备了C4途径的先决条件。第二，据我们所知，没有新的基因和C4途径相关：C4循环所需要的所有酶都可以在C3植物中找到，尽管它们可能积累量很低，或者被认为是使管家基因的功能。事实上，C3植物拥有C4途径的特点在细胞学上，比如像是的茎和叶柄中的导管。第三，尽管到目前为止只有一个研究说明，C3和C4植物成熟叶片的转录组大约有3%不同。第四，这些叶片转录组的不同很大比例是由于C4的叶片初级代谢的不同而引起的次级代谢的不同，或者是这两种植物在系统发育过程中的不同。这在某种程度上可以通过估 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 分C4循环在叶肉细胞和鞘细胞的分布的影响来检测。最后，最近的在测序方面、蛋白质组以及C4基因组的研究，用系统生物学的方法解剖了C4途径。比较转录组学和蛋白质组学提供了玉米和水稻中叶肉细胞和鞘细胞中C4基因表达和蛋白质积累的不同，以及相应的玉米叶片进化发育的梯度，还有C3和C4植物较远和较近关系的比较。将来，系统生物学的方法将对C3、C4植物进行多层次的分析，从而揭示C4生物的核心元件。综上所述，向水稻中引入C4循环看来是可行的。在水稻叶片中引入C4循环当前方法的影响因素：基于现在研究的知识，被用来检测将C4循环分配在水稻叶肉细胞和鞘细胞方法的可行性，是从以下几点进行分析：1.C4植物的一些基因的启动子在水稻中有一定的特征，使这些基因在水稻细胞中特异性表达。例如：ZmPEPC和ZmPPDK的启动子在水稻中产生强的叶肉细胞特异性表达，然而，ZjPCKI启动子在水稻鞘细胞和维管组织中特异性表达。酶活性的正确调控是C4途径的关键点。例如，PEPC和PPDK在C4植物光反应中分别通过PEPC激酶和PPDK调控蛋白的转录后修饰被激活。然而，玉米PEPC的磷酰化和水稻的不同。不正确的调控或C4酶的组成型激活会使C4循环更复杂，产生无效途径。C4循环需要代谢物在不同的亚细胞组织间大量运输，但是当前在这些步骤中只知局限的几种候选蛋白。这些转运蛋白是C4途径的重要组成部分，如果没有帮助C4代谢物穿过组织膜的转运蛋白，C4循环就不会很好的行驶功能。水稻叶绿体中含有PEPC,说明水稻叶绿体中可能含有无效的代谢循环。PEPC在水稻中定位于叶绿体中很可能在厌氧条件下氮的同化作用中起重要作用。这个发现使往水稻中引入C4循环变得更复杂。解决这个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 的一个方法是研究C4循环在水稻旁边作为野草生长的水生C4植物稗类中是如何进行的。在C3植物叶片中引入单细胞的C4系统没有产生有功能的C4循环。很多年的研究表明C4途径可以增加产量，因此人们做了很多努力往各种各样的C3植物中引入C4循环,包括想水稻、马铃薯、番茄的叶肉细胞中引入部分的C4循环。这些研究在之前广泛报道。水稻中特异性基因的过表达以及它们编码的酶活性的增加已经得到。然而，在这些植株上的负效应是平常的。最近，水稻转化植株产生了一系列的基因(PEPC,MDH,NADP-ME,PPDK),可以行使最基本的单细胞的C4生化循环。这些转基因植物可能因为产生了无效循环通常植株矮小，并且缺乏正确的酶活性调节。应该指出的是在这些植株中，对代谢物转运必须的转运蛋白的表达并没有被修饰。还有一点也应该指出，在一个细胞中具有本底能力聚合CO2的植物依赖于叶绿体中非常大的细胞的进化，从而减少CO2的弥散。另外，最高产量的C4植物使用两细胞系统。因此，继续对单细胞种类的研究可能会帮助我们理解C4光合作用，因此向C3叶片中引入两细胞的C4系统是可行的。向水稻中引入C4光合作用的基因C4水稻协会已经做了很多努力来实现这个目标，本来我们的焦点是阐明向水稻中引入有功能的生化C4途径的可行性。NADP-ME亚型被C4途径选用，因为它在C4植株和模式植物玉米中研究的很清楚，另外，在三个生化亚型中，这个亚型需要最少的酶和转运蛋白。为了在水稻中产生有功能的C4循环，玉米中的一些基因正在被克隆，并且分别引入水稻中。另外，内源的水稻基因被下调。这个工程的第一步是将水稻中典型的编码C4代谢酶整合在一起，并评估其在正确细胞类型中高表达的程度。有功能的两细胞C4循环也需要下调叶肉细胞中卡尔文循环的部分基因的表达。我们正在检测用人工修饰的miRNA来抑制水稻RuBisCO小亚基RbcS的表达。C4途径进化的起始步骤之一是C3植物叶片中的鞘细胞中光呼吸的重定位。为了检测这种修饰的重要性，植物产生了amiRNAs是在叶肉细胞中表达的GDC-H降解。在这些植物中，检测GDC在鞘细胞中是否特异性表达对向植物中引入C4循环以及是否起始了C4叶片中额外的多种效应是必要的。C4工程的第二步包括增加额外的转运蛋白，这些转运蛋白能够增加代谢物在亚细胞之间的传递。候选的转运蛋白已经用玉米C3和C4叶片高表达以及细胞特异性表达的差异蛋白质组的研究鉴定出来。玉米中转运蛋白已经被克隆出来，包括假定的0MT1,DiT1和DiT2，和PPT1。C4水稻工程可能的第三步是和C4叶片相关的叶片解剖学和细胞生物学相关的候选基因的聚集。被引入水稻中编码C4途径各组分的所有基因都需要在叶肉细胞或鞘细胞中正确表达。在水稻中玉米叶肉特异性表达的启动子有ZmPEPC和ZmPPDK的特点，这些启动子成功的在水稻中启动强的叶肉细胞的表达。据我们所知，尽管PEPC和PPDK完整的基因已经替换进入水稻中，但是还没有报道说会产生细胞特异性。另外，对其他基因来说，C4叶片的细胞特异性很明显不被存在于启动子中的元件所介导。因此，为了最大限度的获得每个基因正确细胞特异性，玉米全长基因已经克隆出来了(包括自身启动子，5'和3'的UTRs，外显子和内含子）并引入了水稻中。很可能这些基因中的一些将不产生细胞特异性，因此每个编码序列（CDS）和叶肉细胞特异表达的ZmPEPC的启动子或与鞘细胞的启动子OsPCKI融合，并在3'端加上nos终止子。这种方法确保了每个基因的正确的表达模式。我们现在的策略和之前的有点不同是我们正试图从强启动子处分离我们感兴趣的基因。强的CaMV35S启动子通常被用来启动植物选择标记基因的表达，它可以长距离的增强感兴趣的基因的表达，并且它可能打乱了水稻中C4基因表达的细胞特异性。CaMV35S启动子和玉米中感兴趣基因的植物选择性标记已经分离成两种质粒并被共转进水稻中。尽管我们期望共转后可以在相同的位置表达，但是植物插入位点会有不同的选择，但是如果研究需要，我们可以通过植物的筛选标记得到我们想要的。为了在水稻中表达C4循环，载体分别转化进IR64.每个转基因植株含低拷贝，或者稳定的高拷贝都被鉴定出来，然后植株进行杂交。水稻转化体通常是通过农杆菌介导的对未成熟的愈伤进行感染。经过抗体的筛选，生长得到新的愈伤，可以得到转化的T0代。因为C4循环可能通过杂交得到，最理想的转基因植株是在水稻中转入的基因是单拷贝。然而，大量的T0代植株含多个插入，因此高表达的低拷贝的植株被选择产生T1和T2代，并且后来可以用来研究分离现象。为了建立有功能的C4循环，C4基因的高水平表达应该在正确的细胞中。因此，转基因植株每一代的转入基因的表达应该检测一下，用一下两种方法：通过RT-PCR检测转录水平的表达以及免疫印迹杂交和酶活测定检测蛋白水平的表达。为了检测蛋白是否在正确的细胞中表达,我们使用免疫定位和mRNA原位杂交的结合的方法。为了确定引入到水稻叶片中的C4循环的各组分对叶片的发育或细胞超微结构是否有影响，就像之前报道的对初级代谢，细胞器和叶片构造在个植株中是否有影响。最后，含有正确位点和有活性的蛋白的转基因植物将会通过杂交产生有完整功能的两细胞C4循环的转基因植株。转基因C4水稻的母本需要详细的研究。为了正确的酶功能需要对生化进行详细的研究，C4循环的活性和和碳的固定有关。生理过程，如气体交换和光合作用的效率，将被用来分析C4光合作用在补偿点和量子产量的提高。如果这些结果乐观的话，很可能新兴技术如位点特异性重组或人工染色体工程将被用于减少大量的和这些植物相关的转基因事件，这种第二代方法适用于将性状转入好的植株中。限于土地实验会对水稻产量产生影响。因此，C4光合作用将被转入优质水稻中以适应多种环境和农学研究。C4叶片结构分析尽管C4光合作用的最基本生化反应已经研究了40多年了，但是它的许多其它方面还是无法解释的。据我们所知，控制C4叶片结构的基因一个斗没有鉴定出来，尽管叶片结构的变化很好的阐明并融入两细胞的C4光合作用。同样，主要的C4细胞生物学和超微结构的遗传特点还不是很清楚，包括基因控制的鞘细胞的栓化作用，增加叶肉细胞和鞘细胞之间质膜的通透性，以及叶绿体和它的胞内定位。为了向水稻中引入结构方面的C4变化，遗传因素需要被鉴定。C3和C4植物叶片维管系统有很大区别。两细胞的C4系统的叶片维管密度较大，这也降低了C4酸从叶肉细胞到鞘细胞的传播距离，以及光合产物进入维管结构的距离。C4维管在组织分化和基因表达方面起重要作用。比较C3,C3-C4中间体，和C4物种的叶片维管密度，可以说明维管密度的增加好像先于C4生化反应的进化。理论上的维管的最适密度表明，C3叶片的维管密度在适应环境同时发生了变异。为了理解维管密度的变异，我们选择了两个遗传筛选方法：在活性标签水稻群体中筛选C4性状的出现的突变，和在玉米突变群体中筛选C4性状丧失的突变。为了在C3水稻中研究C4性状，我们正在筛选功能获得性突变。活性标签使用增强元件随机插入基因组，创造出增加表达或者敲除特定基因的植株。现在正在筛选Indica和Japonica水稻的活性标签的水稻群体，为了获得降低维管间距和C4类叶片结构的植株。总共要筛选60000个植株，其中只有0.1%的维管密度受影响。初步结果看起来很有希望，因为一些突变植株增加了维管密度，并且减少了维管间的叶肉细胞的数目。这些增加维管密度的水稻植株能够直接作为引入C4生化反应的受体植株。相应的，玉米的传统的丧失性突变用来研究C4性状的缺失。玉米突变群体是通过EMS和伽马射线处理的，有超过70000个M2突变。降低维管密度和增加维管间鞘细胞数目的突变已经成功获得。这些从水稻和玉米突变中得到的潜在的C4维管密度基因已经被鉴定并被应用于C4工程。水稻和玉米突变群体也被用于生理学C4性状的出现和丧失筛选。C4植物的碳固定机制需要在低CO2的条件下进行碳的同化作用，表明需要一个低的碳补偿点。因此，玉米突变体的筛选需要在低CO2的浓度下生长，表现为植株矮小，但可以在高CO2浓度条件下恢复正常。之前的结果表明在玉米突变体中增加碳补偿点和降低维管密度要同时发生。C4植物的效率也与叶片叶绿素和a/b的比例改变有关，因此也筛选了和叶绿素变化有关的活性水稻基因。有趣的是，和典型的C3植物相比，育种和进化使水稻在高温条件下的碳补偿点降低。这就说明了由于非C4光呼吸补偿机制出现在叶肉细胞的分裂形状中，并且它可能还不知道C4水稻工程的复杂性。如果不考虑对叶片结构的遗传因素的未知，突变筛选方法将对C4类水稻叶片提供希望。小结：当前水稻产量的增加不足以维持日益增加的人口数。C4植物比C3植物产量高50%，为了增加C3的产量，国际C4水稻协会试图向水稻中引入C4光合作用。两细胞的C4循环被选择用来引入。这个工程涉及典型的NADP-ME亚型途径在水稻叶片中合适细胞中的基因表达。为了复制C4循环，叶肉细胞中的RuBisCO和GDC表达要下调。转基因植株被用来筛选C4酶的活性和定位。为了建立C4途径，也会用到传统的育种方法。协会的其他成员正在寻找C4转运蛋白和一些基因。相对应的，玉米的大片段突变体和水稻活性标签植株被用来筛选控制维管密度和C4相关的性状的基因。通过和协会中其他成员的合作，我们希望这些方法可以很好的增加我们对C4光合作用的理解，从而对将来的C4工程作出一定的贡献。