《环保用微生物菌剂菌种鉴定方法》（征求意见稿）

ICS备案号：XXXXX团体标准T/CECSXXX—XXXX环保用微生物菌剂的菌种鉴定方法MethodsofStrainIdentificationforMicrobialBlendsintheEnvironmentalProtection（征求意见稿）202--发布 202--实施中国 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 建设标准化协会发布T/CECSXXX-202X目次1范围......................................................................12规范性引用文件.............................................................13术语和定义.................................................................14菌种鉴定流程...............................................................25鉴定方法...................................................................36鉴定结果...................................................................57鉴定 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 ...................................................................5附录A（资料性）常用培养基成分...............................................6附录B（资料性）常见霉菌的形态特征观察......................................10附录C（资料性）环保用微生物菌剂中常见菌种类群的生理生化特征测定............11附录D（资料性）常用引物序列................................................12附录E（资料性）环保用微生物菌剂的菌种鉴定报告编制大纲......................13T/CECSXXX-202X环保用微生物菌剂的菌种鉴定方法1范围本文件规定了环保用微生物菌剂的菌种鉴定方法。本文件适用于环保用微生物菌剂的菌种鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法HJ/T415环保用微生物菌剂环境安全评价导则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1环保用微生物菌剂microbialblendsforenvironmentalprotection由一种或多种从自然界分离纯化，通过自然或人工选育（未经基因改造）所获得微生物菌种（株）所组成的，应用于生态环境保护和污染防治的微生物菌剂。[来源：HJ/T415-2008,3.1]3.2细菌bacterium个体微小，结构简单，主要以二分裂方式繁殖的单细胞原核生物。3.3放线菌actinomycete具有菌丝、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的原核微生物。3.4酵母菌yeast单细胞真核微生物，通常以芽殖或裂殖进行无性繁殖，极少数种可产生孢子进行有性繁殖。3.5霉菌mold菌体由分支或不分支的菌丝构成、不产生肉眼可见子实体的霉菌。3.6菌种species由表型特征相似、遗传性状相近的菌株组成，并与其他类群的菌株存在明显差异。3.7菌株strain1T/CECSXXX-202X属于同一个种或亚种，但来源不同的纯培养的后代。3.8培养物culture一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。3.9纯培养物pureculture一定时间一定空间内由单一微生物细胞繁殖产生的细胞群或生长物。3.10纯度 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 purityexamination检测菌种是否为纯培养物的过程。3.11菌落colony在固态培养基上由单一微生物细胞生长繁殖形成的肉眼可见的细胞群体。3.12芽孢spore某些细菌在生长的一定阶段，在细胞内形成圆形、椭圆形或圆柱形结构，对不良环境条件具有较强抗性的休眠体。3.13鉴定identification根据通用的检索系统，对未知微生物菌株进行性状观察和测定，确定该微生物分类地位的过程。4菌种鉴定流程环保用微生物菌剂的菌种鉴定流程见图.1。2T/CECSXXX-202X菌种鉴定启动纯培养物判定否是否为纯培养物退回是培养特征观察与生理生化特性鉴定遗传特性鉴定菌体形态观察鉴定结果的分析、比较及确认编制菌种鉴定报告菌种鉴定结束图1环保用微生物菌剂的菌种鉴定流程5鉴定方法5.1纯培养物检测5.1.1菌落形态观察在适宜培养基平板上，将待鉴定培养物划线或稀释涂布，经适宜条件下培养后，选取划线或稀释涂布分离得到的单菌落，观察其在同一平板上的大小、形状、颜色、质地、光泽等。5.1.2菌体形态观察挑取待鉴定细菌培养物，涂布于载玻片上无菌水滴中，进行简单染色或革兰氏染色；酵母菌和霉菌制成水浸片。显微镜下观察菌体形态。5.1.3纯度确定菌落和菌体均形态一致者，可确定为纯培养物，可进行后续菌种鉴定工作；若非纯培养物，则退回。3T/CECSXXX-202X5.2培养特征观察方法5.2.1细菌将待鉴定培养物划线或稀释涂布于营养肉汤培养基（见附录A)或其他适宜的细菌培养基平板上，适宜条件下培养2d～5d后，观察和记录幼龄和老龄菌落的大小、形状、质地、边缘、隆起、颜色、光泽、透明度等性状。5.2.2放线菌将待鉴定培养物点植、划线或稀释涂布于适宜的培养基平板上，28°C培养5d～15d，观察菌落的大小、形状、表面状况、气生丝、基内菌丝的颜色及可溶性色素。5.2.3酵母菌将待鉴定培养物划线或稀释涂布于麦芽汁琼脂（见附录A)平板上，25℃～28℃培养3d～7d，观察菌落的大小、形状、质地、隆起、边缘、颜色、光泽等性状。将待鉴定培养物接种于麦芽汁液体培养基（见附录A)中，25℃～28℃培养3d，观察是否形成菌膜、菌环或岛及沉淀。5.2.4霉菌将待鉴定培养物点种或稀释涂布于PDA培养基（见附录A)或察氏培养基（见附录A)平板上，25℃～28℃培养2d～14d，观察菌落质地、颜色、生长速度、色素的产生情况、渗出液、菌落背面的颜色等。5.3菌体形态特征观察方法5.3.1细菌挑取在适宜培养基上生长的幼龄培养物，涂片、革兰氏染色，显微镜下观察菌体形状、大小、革兰氏染色反应等，观察芽孢的有无、形态和着生位置。5.3.2放线菌将数个灭菌盖玻片均匀斜插入培养皿中将要凝固的培养基中，待培养基凝固后沿盖玻片与培养基的交接处划线接种放线菌，正置培养皿于28℃培养数天，定期取出盖玻片，用显微镜观察气生菌丝、基内菌丝、孢子丝的形态，孢子着生方式、颜色或孢囊着生位置、孢囊的形状。5.3.3酵母菌将待鉴定培养物接种于麦芽汁液体培养基（见附录A)中，25℃～28℃培养3d，挑取一环培养物，压滴法制成水浸片，观察细胞大小、形态和无性繁殖方式。在玉米粉琼脂（见附录A)平板上划线接种待鉴定培养物，盖上盖玻片，25℃～28℃培养3d～5d，低倍显微镜下4T/CECSXXX-202X观察划线处是否形成假菌丝。在适宜生孢子培养基上观察孢子的形态特征。5.3.4霉菌将待鉴定培养物接种于PDA培养基（见附录A)或察氏培养基（见附录A)平板或斜面上，25℃～28℃培养2d～14d，挑取少量培养物压滴法制成水浸片，或采用玻片培养法（见附录B)，显微镜下观察菌体形态特征、无性繁殖体和有性繁殖体的形态特征（见附录B)。5.4生理生化特性鉴定参考附录C所列的待鉴定培养物类群及其他资料，测定对应的生理生化项目。可利用微生物自动鉴定系统进行鉴定，方法参照所利用的微生物自动鉴定系统技术资料。5.5遗传特性鉴定细菌和放线菌可进行16SrDNA序列、gyrB基因序列测序分析，酵母菌、霉菌可进行26SrDNA中D1/D2区域序列、18SrDNA序列或ITS序列测序分析。序列测定的常用扩增引物见附录D。6鉴定结果根据实验结果，对照通用的鉴定系统，确定待鉴定菌株的分类地位。菌种名称采用国际命名规则，使用属名和种加词的拉丁词，并附加中文译名。有异名的应同时标注。7鉴定报告菌种鉴定结果报告应列出送检单位、送检时间、样品编号、名称、数量、鉴定操作人姓名（签字）、鉴定技术负责人姓名（签字）、鉴定内容、结果等信息。采用微生物自动鉴定系统和（或）序列测定的，应附上原始数据。鉴定报告编制大纲可参考附录E。5T/CECSXXX-202X附录A（资料性）常用培养基成分A.1营养肉汤培养基蛋白胨10.0g牛肉膏；3.0g氯化钠（NaCl)5.0g琼脂18.0g蒸馏水1000mlpH7.0~7.2A.2乳酸细菌培养基（MRS培养基）蛋白胨10.0g牛肉膏10.0g酵母膏5.0g柠檬酸氢二铵[(NH4)2C6H6O7]2.0g葡萄糖（C5H1206•H2O)20.0g吐温801.0g乙酸钠（CH3COONa•3H2O)5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4•3H2O)2.0g硫酸镁（MgSO4•7H2O)0.58g硫酸锰（MnSO4•H2O)0.25g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH6.2~6.5A.3高氏合成一号琼脂6T/CECSXXX-202X硝酸钾（KNO3)1.0g磷酸氢二钾（K2HPO4•3H2O）0.5g硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.5g氯化钠（NaCl）0.5g硫酸亚铁（FeSO4•7H2O)0.01g可溶性淀粉［(C6H10O5)n]20.0g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH7.2~7.4A.4葡萄糖-天门冬素琼脂葡萄糖（C6H1206•H2O)10.0g天门冬素0.5g磷酸氢二钾（K2HPO4•3H2O)0.5g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH7.2～7.4A.5无机盐淀粉琼脂可溶性淀粉［(C6H10O5)n]10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4•3H2O)1.0g硫酸镁（MgSO4•7H2O)1.0g氯化钠(NaCl)1.0g硫酸铵［(NH4)2SO4］2.0g碳酸钙(CaCO3)2.0g微量元素盐溶液1.0mL琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH7.0～7.4微量元素盐溶液：7T/CECSXXX-202X硫酸亚铁（FeSO4•7H2O)0.1g氯化锰（MnCl2•4H2O)0.1g硫酸锌（ZnSO4•7H2O)0.1g蒸馏水100mLA.6燕麦粉琼脂燕麦片20.0g微量元素盐溶液1.0mL琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH72～7.4微量元素盐溶液：同A.5。在1000mL蒸馏水中煮沸20.0g燕麦片，通过纱布过滤，加微量元素盐溶液，补加蒸馆水至1000mL。A.7葡萄糖酵母膏麦芽膏琼脂（GYM琼脂）葡萄糖（C6H12O6•H2O)4.0g酵母膏4.0g麦芽提取物10.0g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH7.2～7.4A.8察氏（Czapeks）培养基蔗糖（C12H22O11)30.0g磷酸氢二钾（K2HPO4•3H2O)1.0g硫酸镁(MgSO4•7H2O)0.5g硝酸钠（NaNO3)3.0g氯化钾(KCl)0.5g8T/CECSXXX-202X硫酸亚铁(FeSO4•7H2O)0.01g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH6.0～6.5A.9麦芽汁琼脂培养基麦芽提取物20.0g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH54～6.0A.10玉米粉琼脂玉米粉12.5g琼脂5.4g蒸馏水300mLpH6.0～6.5称取玉米粉，加300mL蒸馏水搅匀，60℃热水浴保温1h，用滤纸过滤，滤液加水至300mL。A.11马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基）马铃薯200g葡萄糖（C6H12O6•H2O)20.0g琼脂18.0g蒸馏水1000mLpH6.0～6.5称取去皮马铃薯200g切块，放入水中煮沸30min，用双层纱布过滤取汁，补足水至1000mL。9T/CECSXXX-202X附录B（资料性）常见霉菌的形态特征观察B.1玻片培养法将灭菌的载玻片放入培养皿中，接种霉菌孢子，用无菌滴管吸取少量冷却到45℃左右的马铃薯琼脂培养基，滴加到载玻片的孢子上，盖上灭菌的盖玻片，轻压使培养基成一薄层，适温下培养。如培养的时间较长，需注意保湿，防止琼脂培养基过早干燥。经过一定的时间培养，取出载玻片，显微镜下观察菌体的形态特征。B.2常见霉菌的形态特征观察常见霉菌的菌体形态特征观察见表B.1。表B.1常见霉菌的菌体形态特征观察类群菌体形态特征观察主要内容根霉、毛菌丝分隔、分枝情况、假根的有无、着生方式；孢囊梗长短、簇生或单生、霉分枝的类型；孢囊形状、大小、内含孢囊孢子的数量；囊轴形状、大小、颜色；囊托的有无、形状、大小；孢囊孢子形状、大小；厚垣孢子的有无；接合孢子是同宗还是异宗配合、结合孢子柄形状、大小。曲霉菌丝分隔、分枝情况；分生孢子梗着生方式；分生孢子头和顶囊的形状、大小、颜色；瓶梗的层次、颜色；梗基的有无；分生孢子的形状、大小、表面情况。青霉菌丝分隔、分枝情况；分生孢子梗着生方式、分校情况；帚状枝的形状；瓶梗、梗基和副枝数目、大小；分生孢子的形状、大小。木霉菌丝分隔、分枝情况；分生孢子梗的分枝状态；小梗的形状、大小；分生孢子的形状、大小、色泽；厚垣孢子的有无。10T/CECSXXX-202X附录C（资料性）环保用微生物菌剂中常见菌种类群的生理生化特征测定环保用微生物菌剂中常见菌种类群的生理生化特征测定见表C.1。表C.1常见菌种类群的生理生化特征测定类群生理生化特征测定芽孢杆菌氧化酶；接触酶；卵磷脂酶；厌氧生长；糖、醇类发酵；V-P测定；淀粉水解；酪素水解；丙酸盐利用，硝酸盐还原；脲酶水解；吲哚产生；苯丙氨酸脱氨酶；对温度、pH的需求及耐受性；对盐的耐受性等。乳酸杆菌氧化酶；接触酶，葡萄糖产酸产气；碳水化合物发酵产酸；精氨酸产氨；淀粉水解；七叶灵水解；牛奶的凝固和胨化；硫化氢产生；明胶液化等。根瘤菌氧化酶，接触酶，碳源利用；BTB反应；石蕊牛奶反应；营养肉汁生长；苯丙氨酸脱氨酶等。放线菌碳源利用；明胶液化；淀粉水解；牛奶的凝固和胨化；纤维素分解；硝酸盐还原；硫化氢产生；酪氨酸酶产生，类黑色素产生等。酵母菌碳源利用；糖类发酵；氮源的同化，在无维生素培养基中的生长情况测定；温度生长试验；尿素分解；脂肪酶分解；明胶液化，石蕊牛奶反应；对盐的耐受性；抗放线菌酮测试等。11T/CECSXXX-202X附录D（资料性）常用引物序列常用引物序列见表D.1。表D.1常用引物序列引物序列扩增产物8f正向5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’16SrDNA，约1500bp1492r反向5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’27f正向5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’16SrDNA，约1500bp1492r反向5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’NL-1正向5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'26SrDNAD1/D2,500bp～NL-4反向5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’600bpITS1正向5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS,400bp～700bpITS4反向5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’NS1正向5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-5'18SrDNA，约1800bpNS8反向5’-TCCGCAGGTTCACCTAC-3’Bc1正向5'-ATTGGTGACACCGATCAAACA-3'gyrB基因，约1200bpBc2r反向5'-TCATACGTATGGATGTTATTC-3'12T/CECSXXX-202X附录E（资料性）环保用微生物菌剂的菌种鉴定报告编制大纲一、菌种鉴定基本信息包括：送检单位、送检时间、样品编号、名称、数量、鉴定操作人签字、鉴定技术负责人签字等；二、鉴定内容1、菌种培养特征、菌体形态特征2、菌种生理生化特征3、菌种遗传特性检测三、鉴定结果四、附件（微生物自动鉴定系统和（或）序列测定原始数据等）13