微生物检验技术XLD琼脂（XyloseLysineDesoxycholateAgar）Contents一、培养基的制备技术1二、无菌技术2三、纯培养技术3四、显微技术4五、生化鉴定5一、培养基的制备技术培养基人工配制的，适合微生物生长、繁殖或产生代谢产物的营养基质1.按物理状态来分液体培养基：不含凝固剂，利于菌体的快速繁殖、代谢和积累产物流体培养基：含0.05～0.07%琼脂粉，有利于一般厌氧菌的生长繁殖半固体培养基：含0.2～0.8%琼脂粉，多用于细菌的运动能力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料等固体培养基：含1.5～2.0%琼脂，多用于细菌的分离、鉴定、菌种保存及细菌疫苗制备等方面（一）培养基的类型2.按成分来分１）天然培养基：指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。例如：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等２）合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，是用已知化学成分的化学药品配制而成３）半合成培养基(综合培养基）：在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等3.按功能来分选择性培养基——含有目标菌生长需要的特殊营养物质,抑制非目标菌生长的抑制剂选择性增菌培养基——液体选择性分离培养基——固体鉴别培养基——通过指示剂或指示剂和抑菌剂的共同作用来鉴别不同类型的微生物4.按制备方法分类自行配制——成本相对较低，但繁琐，质量不稳定。即用型培养基——使用方便，但保质期短。干粉培养基——使用方便，质量稳定，易保存，推广空间广阔。（二）培养基中的成分1.水：自来水、蒸馏水2.琼脂：透明、无味，化学结构稳定，不易被微生物分解利用，在培养基中仅起凝固剂的作用3.氮源（1）有机氮源（2）无机氮源硫酸铵尿素碳酸氢铵硝酸铵氮气等4.碳源类5.稀释溶液磷酸盐缓冲液、生理盐水、缓冲蛋白胨等6.无机盐锌、钴、锰、铁、钙、铜、镁、硫、磷、钾、钠7.生长素氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等8有鉴别指示作用的成分pH指示剂观察各种细菌对糖、醇和苷类等碳水化合物的发酵反应糖、醇、苷类用以鉴别细菌的发酵。有机酸盐类pH值下降，使指示剂的颜色改变；铅盐沉淀氨基酸和蛋白质靛基质、霍乱红和硫化氢反应；蛋白胨、氨基酸、尿素以及明胶等酶解试验其他鉴别成分卵磷脂（或卵黄）、磷酸酯、甘油三丁酯、吐温等酶类水解试验。（三）培养基的制备和使用1.称量和复水2.溶解3.pH值调节4.分装5灭菌和贮藏煮沸湿热灭菌或过滤除菌添加成分4℃冰箱内备用6.使用琼脂培养基的融化添加成分的加入培养弃置二、无菌技术几个常见的概念：灭菌、消毒、防腐无菌技术二.无菌技术1.常用器具的灭菌常用器具：试管、烧瓶、培养皿、涂棒、移液管、接种环等方法：这些器具在灭菌前须先进行包扎或装入特定容器中。（1）高压蒸汽灭菌0.1MPa121.3℃15~30min（2）高温干热灭菌160~170℃2h（3）烧灼灭菌2.培养基的灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌：适于不耐温的材料3.操作台、无菌室（无菌箱）紫外杀菌、臭氧消毒、消毒剂等无菌技术的用具和设备接种环和接种针酒精灯超净台/生物安全柜无菌室无菌操作在火焰旁或无菌箱、超净工作台上操作。倒平板无菌操作三、纯培养技术纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术纯培养（pureculture）：微生物学中将在实验室条件下，从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代，称为纯培养混合培养物：含有两种以上微生物的培养物二元培养物：只含有二种微生物，并保持二者之间特定关系的培养物1.稀释平板法无菌操作（一）稀释法2.液体稀释法：适于细胞较大的微生物待分离材料→接种于培养液中→培养→测定或估计单位容积中的含菌数目→稀至两、三滴液体中只含有一个微生物个体→每次取一滴至另一盛有新鲜培养基的试管中→摇匀，培养→观察→大多数试管无微生物生长，少数管底有一菌落，可能由一个细胞繁殖而来。3.稀释摇管法：适于分离严格厌养菌。一系列盛由固体培养基的试管→加热熔化→冷却至50℃左右加入待分离材料进行梯度稀释→迅速摇匀→冷凝→倾注一层灭菌过的石蜡→培养→挑取单个菌落.（二）平板划线分离法（三）单细胞（单孢子）挑取法适用于分离混杂微生物中弱势群体方法：（1）用显微操作仪在显微镜下用毛细吸管或显微针、钩、环等挑取→获得纯培养（2）用一般显微镜，将一滴经适当稀释后的菌液置于载玻片上，选取只含有一个细胞的液滴进行纯培养的分离此法多限于高度专业化的科学研究中采用（四）利用选择培养基分离法1.抑制其它微生物的生长控制pH、温度，加抗生素等2.富集培养光照、温度、高压、紫外线、氧气、营养等通过设置有利于某些或某一微生物生长的特定条件，使适应该条件的微生物旺盛生长此法易分离到某些特定微生物或弱势微生物斜面接种接种技术液体接种穿刺接种菌落形态观察菌落形态一般在培养24～48h内肉眼观测，不同培养基菌落形态可发生变化。菌落的特征一般根据下列各项的观察来表示包括菌落大小、形状、高度、边缘、颜色、表面状态、密度、硬度等液体培养基中生长状况观察细菌个体基本形态和特殊结构观察个体基本形态球菌、杆菌、螺旋菌特殊结构观察荚膜、芽孢、鞭毛四、显微技术（一）显微镜构造使用方法①低倍镜的使用②高倍镜的观察③油镜的观察注意事项①取放时动作一定要轻②观察带有液体的临时标本时要加盖片③粗、细调节钮要配合使用④观察时要从低倍镜开始，看清标本后再转用高倍镜、油镜。⑤使用油镜时一定要在盖玻片上滴油后才能使用。⑥不可用手摸光学玻璃部分⑦使用的盖玻片和载玻片不能过厚或过薄。⑧凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品⑨实验完毕，放回镜箱。切不可把显微镜放在直射光线下曝晒。油镜的工作原理加油原因：1.增加视野亮度2.增加分辨率：最小可分辨距离=λ/2NANA=n.Sinα暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜1.简单染色制片——固定——吕氏碱性美蓝染液(或石碳酸复红染液)染色1-2分钟——水洗——干燥——镜检（二）染色技术2.革兰氏染色革兰氏染色的机制程序：（1）初染（结晶紫，30S）（2）媒染剂（碘液，30S）（3）脱色（95%乙醇，10～20S）（4）复染（蕃红，30～60S）结果判断：菌体呈紫色的为革兰氏阳性菌（G+）菌体呈红色的为革兰氏阴性菌（G-）大肠杆菌（G-）枯草芽孢杆菌（G+）沙门氏菌（G-）金黄色葡萄球菌（G+）粪肠球菌（G+）五、微生物的生化鉴定（一）糖苷醇类代谢试验1.糖发酵试验2.ONPG试验3.MR,V-P试验4.七叶苷水解试验（二）氨基酸和蛋白质代谢1.靛基质试验2.氨基酸脱羧酶试验3.硫化氢试验4.苯丙氨酸试验5.尿素酶试验（三）碳源和氮源利用试验1.柠檬酸盐利用试验1.凝固酶试验（四）酶试验2.硝酸盐还原试验3.溶血试验（五）抑菌试验氰化钾试验4.抗原抗体反应的种类（六）血清学试验凝集反应Clicktoeditcompanyslogan.
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