第三章药物的杂质检查§1药物的杂质与限量§2杂质的检查方法§3一般杂质的检查§4特殊杂质的检查与鉴定方法123熟悉了解掌握药物中杂质的来源和分类杂质限量的概念和计算一般杂质和特殊杂质检查方法药物中杂质鉴定方法热
分析
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法基本原理及在杂质研究中应用本章学习要求药物的杂质与纯度1药物杂质的来源2药物杂质的分类3药物杂质的限量4§1药物的杂质与限量药品纯度药物的纯洁程度,反映药品质量的一项重要指标。主要由药品质量标准中的“检查”项下的杂质检查来控制。注意药物纯度与化学纯度的区别？药物纯度的评价药物的性状、理化常数、杂质检查、含量测定等作为一个有联系的整体来评价药物的纯度。二、杂质的来源杂质的来源生产过程储藏过程合成过程中,原料不纯或反应不完全，中间体、副产物在精制中未除尽制剂过程试剂、溶剂、还原剂残留异构体、多晶体使用的金属器皿、装置、工具引入的金属杂质毒性杂质:对人体有毒害的杂质,如重金属、砷盐信号杂质:一般无毒,含量多少反映药物的纯度,如氯化物、硫酸盐一般杂质:多种药物生产或贮存过程中易引入杂质;含量高低与生产
工艺
钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程
水平有关。特殊杂质:特定药物生产或贮存过程中引入的,随药物不同而改变无机杂质:源于生产过程,如反应试剂,配位体,催化剂,重金属等有机杂质:未反应完全的原料,中间体,副产物,分解物残留溶剂:生产中使用有机溶剂毒性和信号杂质无机有机杂质和残留溶剂三.杂质的分类毒性来源一般和特殊杂质化学类别和特性有关物质检查方法限度检查法定量测定对照法比较法灵敏度法杂质限量控制例1茶苯海明中氯化物检查:取本品0.30g置200ml量瓶中,…加硝酸银试液25ml,…取续滤液25ml置50ml纳氏比色管中,…用水稀释成50ml,…与标准氯化钠溶液(10μgCl/ml)1.5ml制成的对照液比较,求氯化物限量。例3卡比马唑片(规格5mg)中甲巯咪唑检查:取本品20片,…置10ml量瓶中,加…至刻度,…作为供试品;另取甲巯咪唑对照品,…制成100μg/ml溶液,分别取上述两溶液各10μl,展开,显色。供试液杂质斑点颜色与对照品比较不得更深。求杂质限量。杂质研究规范p102有机杂质在质量标准中项目名称检查项目的确定限度的确定检查方法的选择杂质检查方法化学法(显色,沉淀,产生气体,滴定法)色谱法(TLC,HPLC,GC)光谱法(UV-vis,IR,AAS)热分析法)§2杂质的检查方法项目名称杂质的化学名以某类杂质名根据检测方法选用肾上腺素中的“酮体”利巴韦林中“有关物质”“杂质吸光度”一.杂质研究规范经研究和稳定性考察检出的,并在批量生产中出现的杂质和降解产物。根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项目规定降解产物和毒性杂质的检查项目其可能共存的其他对映体应作为杂质检查消旋体药物新药原料药和制剂中的杂质单一对映体药物当已有其单一对映体药物法定质量标准时,应在该消旋体药物质量标准中设旋光度检查项。2.杂质检查项目的确定针对性3.杂质限度的确定根据每日剂量来制订质控限度有机杂质的限度规定应包括：每一个已知杂质、未知杂质及总杂质。仿制药品的杂质限度，应与已上市产品进行质量对比研究。药品安全＋生产可行＋批间波动＋药品稳定性制订杂质限度应考虑的因素+→5-氯-水杨酸2-氯-4-硝基苯胺氯硝柳胺二.杂质检查方法1.化学法(显色反应）杂质：5-氯-水杨酸紫色配合物灵敏度法检查2.沉淀反应:盐酸肼屈嗪中游离肼检查肼与芳醛产生腙沉淀3.生成气体:NH34.滴定法:如硫酸亚铁中高铁盐检查已知杂质并能制备杂质对照品供试品溶液;一定浓度杂质对照品溶液;分别点样于同一硅胶薄层板上，展开、定位;比较、判断；确证色谱系统分离效能:杂质对照液与供试液成混合对照溶液。⑴杂质对照品法供试液(10mg/mL),氟喹啉酸(30μg/mL),混合对照液(1:1)各5μL,点样,展开混合对照液:环丙沙星与氟喹啉酸完全分离供试品中杂质斑点≯相应杂质对照斑点(0.3%)例盐酸环丙沙星中氟喹啉酸检查⑵供试液自身稀释对照法杂质结构不确定或无杂质对照品供试液按限量要求稀释至一定浓度作为对照液供试液和对照液分别点样、展开、定位供试液所显杂质斑点≯对照液所显主斑点⑶杂质对照品与供试品溶液自身稀释对照并用杂质有对照品:杂质对照法检查；未知杂质或无对照杂质:供试液自身稀释对照法检查供试品溶液:20mg/ml对照溶液:0.10mg/ml对照品溶液:3-甲基黄酮-8-羧酸0.10mg/ml判断:供试品溶液杂质斑点≯2个与对照品溶液相同的位置上所显杂质斑点的颜色≯对照品溶液主斑点，另一杂质颜色≯对照溶液主斑点。例盐酸黄酮哌酯中有关物质的检查稀释无合适杂质对照品或供试品显示的杂质斑点颜色与主成分斑点颜色有差异与供试品相同药物作对照品。对照药物中所含待检杂质符合限量要求⑷对照药物法供试液1:5mg/ml;供试液2:0.2mg/ml;对照品(药物):5mg/ml点样10μl;展开、检视；供试液1与对照液主斑点相同;供试液1杂质斑点颜色≯对照液对应杂质斑点颜色供试液2只显主斑点例马来酸麦角新碱中有关物质检查该方法仅能定性或半定量薄层扫描法:定量分析,具有分离效能高、快速、简便等特点,精密度和准确度不如HPLC法高,作为HPLC补充,用于无紫外吸收或不能用HPLC法分析的组分检查系统适用性试验TLC检测灵敏度分离效能比移值（Rf）限量要求：规定杂质斑点数和单一杂质量、杂质总量HPLC法外标法(杂质对照品法)加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法面积归一化法(p108-110)供试品溶液杂质对照品溶液供试品溶液对照品溶液进样AX和AR记录色谱图计算⑴外标法(杂质对照品法)例卡托普利及其片剂中卡托普利二硫化物检查供试品溶液:0.5mg/ml对照品溶液:卡托普利二硫化物对照品,5μg/ml混合溶液:卡托普利和卡托普利二硫化物对照品0.1mg/ml和15μg/ml适用性试验:混合溶液;R>4.0原料药:二硫化物含量≯1.0%,片剂:二硫化物含量≯3.0%卡托普利标示量⑵加校正因子的主成分自身对照法AS,CS:药物对照品峰面积和浓度；AR,CR:杂质对照品峰面积和浓度；AS’,CS’:对照液(供试品稀释液)药物峰面积和浓度；AX,CX:供试液中杂质峰面积和浓度适用于已知杂质控制杂质校正因子消除杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差例红霉素A中红霉素B、C组分及有关物质检查稀释供试品溶液:4mg/ml对照溶液:(0.2mg/ml)调灵敏度:对照溶液,h主约为满量程的20%进样:供试品溶液;对照溶液分析时间:4t主f红霉素A1.0;f红霉素B0.7;f红霉素C1.0;f红霉素烯醇醚0.09判断：A红霉素B校正、A红霉素C校正
105kPa)能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度,大大缩短分析时间,适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。LC-MS法对色谱峰进行峰纯度检查,以验证分析方法的可靠性;通过高分辨质谱提供的元素组成信息和LC-MS-MS法提供的碎片离子信息推断杂质结构LC-NMR:用于药物中杂质、药物代谢的产物以及手性药物的分析等药物和杂质紫外特征吸收差异；地蒽酚中二羟基蒽醌检查二羟基蒽醌:λmax432nm；地蒽酚:该波长下无吸收。3.光谱法(UV)二羟基蒽醌的规定：A432≯0.12；杂质限量≤2.0%。药物中无效或低效晶形的检查晶形结构不同，键长、键角发生不同程度变化某些特征峰的频率、峰形和强度差异。IR氯化物（硫酸盐、铁盐）检查重金属检查砷盐检查干燥失重炽灼残渣残留溶剂§3一般杂质检查方法p118-1291.原理（白色浑浊）与一定量标准NaCl液同条件下产生的AgCl比较浑浊程度;标准氯化钠溶液浓度:10gCl/mL一.氯化物检查法2.方法样品管对照管3.注意平行试验反应最佳条件硝酸酸性氯化物范围:50mL供试液含Cl50～80μg观察比较衬于黑色背景自上而下观察；暗处放置5min。二、硫酸盐检查法标准：100μgSO42-/ml红色标准：10μgFe/ml三、铁盐检查法（硫氰酸铁法）方法适用范围第一法硫代乙酰胺法溶于水、稀酸、乙醇的药物第二法炽灼后的硫代乙酰胺法含芳环、杂环及难溶于水、稀酸、乙醇的药物第三法硫化钠法溶于碱性水溶液而难溶于稀酸或在稀酸中生成沉淀的药物四、重金属检查法(Pb)实验条件（溶液pH）下,与硫代乙酰胺或硫化钠作用呈色的金属。检查重金属时以Pb为代表1.硫代乙酰胺法条件介质：醋酸盐缓冲液(pH3.5)试剂：CH3CSNH2杂质对照液：Pb(NO3)2(10µg/ml)灵敏度范围：10~20g/27ml黄色至棕黑色混悬液原理:2.炽灼后的硫代乙酰胺法缓缓炽灼放冷H2SO40.5-1.0ml供试品炭化加热HNO3500-600℃H2SO4除尽放冷完全灰化蒸干HCl2ml水15ml中性按第一法检查蒸干氨试液注意：做空白试验3.硫化钠法五.砷盐检查法（古蔡氏法）原理：Zn与酸产生新生态氢，与药物中微量砷盐生成挥发性AsH3，遇HgBr2试纸产生黄色至棕色砷斑方法：古蔡氏法检砷器8cm有孔玻璃旋塞导气管AsH3发生瓶溴化汞试纸醋酸铅棉花(60mg)HClZn粒碘化钾试液酸性氯化亚锡试液生成砷斑吸收硫化氢气体讨论标准砷溶液:As2O3配制贮备液，临用前稀释成1μgAs/mL酸性SnCl2:As5+→As3+KI作用：As5+→As3+，KI→I2→I－Zn2+不断被消耗使生成AsH3的反应向右进行。PbAc2棉花作用：排除硫化物干扰。样品或Zn粒中含硫化物时，酸性溶液中产生H2S气体能与HgBr2试纸作用产生色斑。H2S与PbAc2反应生成PbS沉淀留在棉花上二乙基二硫代氨基甲酸银法[Ag(DDC)法]红色胶态银目视比色法510nm测定A值线性范围：1～10μg/40ml含锑药物不干扰测定用于砷盐的限量检查和微量砷盐的含量测定干燥失重:规定条件下，药品经干燥减失量(%)检查药物中水分及其他挥发性物质。恒重:供试品连续两次干燥或炽灼后称重差异≤0.3mg六、干燥失重法分类适用范围温度常压恒温干燥法受热稳定药物105℃减压干燥法与恒温减压干燥法熔点低或受热分解供试品60℃干燥剂干燥法受热分解或易升华供试品常温测定方法有机药物经炭化或挥发性无机药物加热分解后，高温炽灼所产生的非挥发性无机杂质的硫酸盐。0.1%～0.2%七、炽灼残渣残留溶剂：在合成原料药，辅料或制剂生产的过程中使用的，但在工艺中未能完全除去的有机溶剂。填充柱检查方法：GC法毛细管柱检测器：FIDECD：含卤素残留溶剂八、残留溶剂法分类毒性使用举例一类溶剂毒性较大，致癌,对环境有害避免使用苯，四氯化碳二类溶剂有一定毒性限制使用乙腈,三氯甲烷,二氯甲烷,吡啶,四氢呋喃,甲苯三类溶剂危险性较小推荐使用乙酸，乙醚，乙醇，乙酸乙酯，甲酸四类溶剂尚无足够毒理学资料石油醚，三氯乙酸药品中常用残留溶剂用待测物色谱峰计算，填充柱n>1000；毛细管柱n>5000待测物与邻峰R>1.5；内标法：对照液进样5次，所得待测物与内标物峰面积之比的RSD≯5%；外标法：所得待测物峰面积的RSD≯10%系统适用性试验测定方法分类适用范围第一法毛细管柱顶空进样等温法被检有机溶剂数量少且极性差异小第二法毛细管柱顶空进样程序升温法被检有机溶剂数量多且极性差异大第三法溶液直接进样法顶空进样：样品溶液于密闭容器中，一定温度下加热一段时间，气液达平衡，取气相部分进行GC，测定样品上方蒸气中组分在原样品中含量免去样品萃取、浓集等，避免供试品中非挥发组分对色谱柱的污染顶空平衡时间30～60min;平衡温度低于溶解供试品所用溶剂沸点10℃以下水溶性药物：水为溶剂；非水溶性药物：二甲亚砜(DMSO),N,N-二甲基甲酰胺(DMF)对照液和供试液的基质差异用标准加入法消除特殊杂质研究规范特殊杂质鉴定合成杂质对照品法色谱制备杂质对照品法§4特殊杂质检查与鉴定方法超过鉴定限度的杂质:确定来源,推测可能结构,判断该杂质对药物安全性的影响;稳定性研究中产生的超过鉴定限度的降解产物也应做相应的结构鉴定。有关物质的定性研究:获得有关物质结构信息;其形成过程的分析:设法避免该杂质产生,或经纯化使之含量降至最低。《化学药物杂质研究的技术指导原则》2005年药物中有关物质结构研究的步骤采用不同分离机制的色谱分离方法检测有关物质,结合合成、制备路线与MS的检测推测有关物质的可能结构,然后取可能存在的杂质(如合成过程中的原料、中间体等)与含杂质的药物进样,在相同的色谱条件下考查已知化合物与该杂质的保留时间是否一致;也可将已知化合物加入含杂质的药物中,考查拟确定的杂质峰面积是否有变化。利用DAD,观察拟定性的有关物质的紫外吸收,或与已知化合物的紫外吸收光谱进行对比,分析该杂质结构中可能存在的官能团。采用GC-MS或LC-MS-MS联用技术,为有关物质的结构确定提供相关信息;或利用LC-IR和LC-NMR等联用技术,在不分离杂质的情况下在线获得杂质的IR和NMR图谱;或利用制备型色谱获得有关物质的样品,然后通过IR、MS、NMR的检测,确定有关物质的结构。合成已知结构的有关物质,并与药物杂质的色谱数据和光谱信息进行对照,以确定有关物质,并建立其定量测定方法。特殊杂质研究规范定性或结构确证表观含量≥0.1%杂质<0.1%强烈生物作用杂质或毒性杂质特殊杂质鉴定合成杂质对照品法杂质量较小，分离纯化困难比较色谱性质、UV特征和MS盐酸非索非那定中杂质鉴定:长期留样杂质2增加1.53%,采用LC-MS鉴定中间体水解得杂质2，HPLC测定合成的杂质2，与留样中杂质2比较tR色谱制备杂质对照品法杂质量较大，分离杂质元素分析，UV、IR、NMR和MS确证炎琥宁有关物质结构鉴定有关物质检查杂质1制备杂质1结构鉴定有关物质检查杂质1制备制备色谱制备；分段收集含杂质流出液；流出液用乙酸乙酯萃取，水浴旋蒸挥干即得杂质1结构鉴定炎琥宁和杂质1单体UV、IR、NMR和LC-MSUV炎琥宁λmax251nm杂质1λmax264nm:C15形成羧基，共轭体系增长IR杂质1：内酯环开环，形成两个羧基νOH3444cm-1;νCH2927cm-1;νCH2854cm-1νC=O1719cm-1;νC=C1614cm-1νC-O1407cm-1;νC-O-C1165cm-1NMR杂质113C-NMR：6个δC=O(C15,C16,C1’,C4’,C1’’,C4’’),比炎琥宁多1个,即C15形成羧基,δ70.4→δ166.4;1H-NMR：低场活泼氢(羧基氢)4个,是PSDS两倍杂质1与炎琥宁母核一致6个烯碳(C8,C11,C12,C13,C14,C17),2个CH3(C18,C20),3组单质子烯氢(δ6.25,5.98,5.79),LC-MSLC-ESI/TOFMS：炎琥宁和杂质1分子量分别532.23100与564.22216;LC-ESI/MSn(杂质1):MS1：m/z587.2[M+Na]+;MS2(m/z587.2):m/z351.3、369.3、425.4、451.2、469.3、487.2和569.3等杂质1[M+Na]的MS2炎琥宁杂质1
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