细菌鉴定中常用的理化生化反应

实验日期：2017.11.1实验班级：生物技术指导教师：张建丽姓名：高熹学号：1120152430细菌鉴定中常用的理化生化反应一、实验目的1)了解细菌生理生化反应原理2)通过细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。3)了解细菌在培养基中生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。二、实验原理1）糖（醇）类发酵实验因细菌所含的酶不同，其发酵糖（醇）后的代谢产物亦不相同，即可产酸产气，或产酸不产气。酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断（pH5.2黄色—6.8紫色），即当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。2）甲基红（Methylred）实验（MR实验）大肠杆菌等许多细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解成甲酸（或乙酸\乳酸）,使培养基的pH降低到4.2以下,此时加入甲基红指示剂，呈现红色。产气杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,培养基的pH在6.2以上,故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。3）伏-普(Voges-Proskauer)氏实验(V.P.实验)4）靛基质(吲哚)实验大肠杆菌等能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。5）硫化氢实验某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸\半胱氨酸等),产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢实验。6）明胶液化实验某些细菌具有胶原酶,使明胶被分解,失去凝固能力,呈现液体状态,为明胶实验阳性。7）淀粉水解实验细菌不能直接利用淀粉,须经淀粉酶将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)后被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即加碘液测定时，不再产生蓝色。8）柠檬酸盐利用实验产气杆菌等能以柠檬酸钠为碳源进行生长。其分解柠檬酸盐后产生碳酸盐,培养基呈碱性.使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色.三、实验试剂及器材实验仪器和用具：恒温培养箱、试管、无菌平皿、杜氏小管、接种环,酒精灯；微生物材料：大肠杆菌,变形杆菌,枯草杆菌,产气杆菌斜面；试剂：甲基红试剂、V.P试剂、吲哚试剂格里斯试剂（A、B）、卢戈氏碘液；培养基：葡萄糖和乳糖发酵培养基（糖类发酵实验）葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和V.P.实验）胰蛋白水培养基（吲哚实验）柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基（硫化氢实验）明胶培养基（明胶液化实验）淀粉培养基（淀粉水解实验）柠檬酸钠斜面培养基（柠檬酸盐利用实验）硝酸盐培养基（硝酸盐利用实验）。四、实验步骤1）糖（醇）类发酵实验1.编号：在试管上标明培养基名称,所接种的菌名和组号.2.接种：取3支葡萄糖发酵培养基,1支接种大肠杆菌，1支接种变形杆菌,留1支不接种，作为对照.3.乳糖发酵试验接种方法同葡萄糖发酵试验。将已接种好的培养基置37℃培养箱中培养24h.4.结果观察:若细菌能发酵培养基中的糖，可使培养基的pH降低,培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色),若发酵糖产酸产气,不仅培养基呈黄色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体（气体占杜氏小管的10%以上）；若被测细菌不分解培养基中的糖,则培养基不发生变化。2）甲基红实验（MR实验）1.取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，标记同上。2.取1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌,1支不接种，作为对照。37℃培养48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果。3.结果：呈现红色者为阳性,呈现黄色者为阴性。3）伏-普实验(V.P.实验)取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支留作对照。37℃培养48h取出,加入40%KOH5-10滴,然后再加入等量的5%α-萘酚溶液,用力振荡,再放入37℃培养箱中保温15-30min加快反应速度.若培养物呈现红色,为伏-普反应阳性。4）靛基质(吲哚)实验取3支胰蛋白胨水培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支留作对照。37℃培养24-48h后,沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面,观察结果.呈现玫瑰红色为阳性,不变色为阴性。5）硫化氢实验取3支醋酸铁或柠檬酸铁半固体培养基，采用穿刺接种法，1支接种大肠杆菌，1支接种变形杆,1支作对照。37℃培养24h观察结果,若有黑色沉淀线出现为阳性。6）明胶液化实验取3支营养明胶培养基，用穿刺接种方法，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌，1支作对照。37℃培养48h后，将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min,观察明胶的液化情况。若明胶不凝固者， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明其已被细菌液化,是为阳性结果。7）淀粉水解实验1.将冷却到50℃的淀粉培养基以无菌操作制成平板。2.用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边,再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。3.置37℃温箱培养24h。4.打开培养皿,将少量卢戈氏碘液滴加于平板上，轻轻摇动,使碘液均匀铺满整个平板.如菌苔有透明圈出现,表明淀粉已被水解.透明圈的大小,说明该菌水解淀粉能力的大小。8）柠檬酸盐利用实验取3支柠檬酸盐斜面培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支作对照。37℃培养24h观察结果.培养基变深蓝色者为阳性.培养基不变色,则继续培养5-7天,培养基仍不变色者为阴性。9）硝酸盐还原实验取3支硝酸盐培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌，1支作对照。37℃培养18-96h,每天吸取培养物2ml加格里斯试剂A液和B液1滴,出现粉红色,玫瑰色,橙色或棕色为阳性.如无阳性反应,可加入1-2滴二苯胺试剂,如培养液呈蓝色,则表示培养液中仍有硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐存在,而无亚硝酸盐存在为阴性.否则,表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都还原成其它物质,仍按硝酸盐还原阳性处理。五、实验结果及 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 （一）糖（醇）类发酵实验：37℃培养24h，葡萄糖（图一）：大肠杆菌：产酸产气；变形杆菌：产酸产气。乳糖（图二）：大肠杆菌：产酸产气；变形杆菌：无明显变化图一图二图三图四（二）甲基红实验（图三）：37℃培养48h，加甲基红指示剂数滴，大肠杆菌：红色（阳性）；产气杆菌：黄色（阴性）（三）V.P.实验（图四）：37℃培养48h取出,加入40%KOH5-10滴,然后再加入等量的5%α-萘酚溶液,用力振荡,再放入37℃培养箱中保温15-30min。产气杆菌：培养物呈现红色（阳性）；大肠杆菌：无明显变化（阴性）（四）靛基质(吲哚)实验（图五）：37℃培养24-48h后,沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面。大肠杆菌：呈现浅红色；产气杆菌：呈现浅红色。图五图六图七（五）硫化氢实验（图六）：37℃培养24h，变形杆菌：有黑色沉淀出现（阳性）；大肠杆菌：无明显变化（阴性）。（六）明胶液化实验（图七）：37℃培养48h后,将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min,观察明胶的液化情况。枯草芽孢杆菌：明胶液化（阳性）；大肠杆菌：明胶不液化（阴性）（七）淀粉水解实验（图八）：37℃温箱培养24h，打开平皿,将少量卢戈氏碘液滴加于平板上，轻轻摇动,使碘液均匀铺满整个平板。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌周围都有透明圈出现，枯草杆菌周围透明圈大于大肠杆菌周围透明圈，证明枯草芽孢杆菌水解淀粉能力更强。（八）柠檬酸盐利用实验（图九）：37℃培养24h，产气杆菌：培养基变深蓝色（阳性）；大肠杆菌：培养基不变色（阴性）图八图九图十图十一（九）硝酸盐还原实验：37℃培养18-96h,每天吸取培养物2ml加格里斯试剂A液和B液1滴。24h后（图十）：大肠杆菌和枯草杆菌加入试剂后均呈现橙色（阳性）；48h后（图十一）：大肠杆菌和枯草杆菌加入试剂后均呈现橙色（阳性）六、注意事项1.实验时,同时以未接种细菌的培养基作对照.因为亚硝酸盐在自然界分布很广,容易污染试剂.另外,硝酸盐不纯或保管不妥,也可能含有亚硝酸盐。2.繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌,如果培养时间过久,可能将亚硝酸盐全部分解成为氨气和氮气,这样可出现假阳性反应,故须每天进行实验。七、思考题1、在吲哚实验和硫化氢实验中细菌各分解何种氨基酸?吲哚实验：细菌分解色氨酸。因为某些细菌含有色氨酸酶，能将色氨酸分解成吲哚，加入吲哚试剂后起颜色反应。硫化氢试验：某些细菌能够分解含硫氨基酸，包括胱氨酸和半胱氨酸搜索，产生硫化氢，加入含铁或铅的试剂后起颜色反应。2、说明硝酸盐还原实验对细菌的生理意义及对农业生产的影响?有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等，因此可以具备部分替代氮肥的能力。八、实验反思实验结束后，应隔一段时间观察结果，不能时间太长，比如划线两天后才观察，已经长成了菌苔。