蛋白组学和肿瘤标志物ppt课件

PowerPointTemplate蛋白质组学技术在肿瘤标志物检测中的应用*危害健康的头号杀手-肿瘤 世界卫生组织最新资料库显示：2005年，全球大约有760　万人死于各种癌症，约1千1百万人被诊断患有癌症。 中国死于恶性肿瘤的人数约为130万人，约2百万人被诊断患有癌症。我国居民每死亡5人中，即有1人死于癌症。 美国从1960到1990的30年间，肿瘤患者的五年存活率由50％上升为63％，主要归功于早期诊断技术的发展，而中晚期的患者的五年存活率，几乎没有提高。*最好的治疗方法就是早期诊断 早期诊断可以治疗癌症，早期诊断癌症的最新、最有效的方法是验血诊断，寻找肿瘤标志，特别是其中的蛋白标志！-LeeHartwell博士，2004年第21届国际肿瘤标志学术会议 目前临床常用的肿瘤标志物有20多种，如PSA、CEA或CA125等，但大部分只能用于疗效的观察、评判预后及预报复发，能用于大规模人群的普查的肿瘤标志物寥寥无几。*DNA/RNAProteinsEnablingProteomics*mRNA 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达蛋白质表达Pharmagene* 蛋白质组学(Proteomics)是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白质。 它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能，而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。 蛋白质组学旨在列出全部蛋白质的细目，弄清每一个蛋白质的结构和功能及蛋白质群体内的相互作用，对比在疾病和健康状态下它们的表达水平的变化。什么是蛋白组学*蛋白组学历史 “proteomics”　始于1994年，与临床检验密切相关 第一个肿瘤标志物－BenceJonesprotein1847. 人类基因组有30000个左右基因，每个基因能编码数个蛋白产物 最高的分离技术仅仅能分离数千个成分 血清或者血浆中蛋白或者多肽的复杂性远远超过目前的分离技术 依赖多重分离手段***蛋白组学技术 现代蛋白质组学的出现和发展，如双向电泳技术、蛋白芯片、飞行时间质谱等技术的发展，给临床肿瘤早期标志物的发现带来了划时代的革命。 传统　一次只能测定一个蛋白　现在　一次可测定数十个甚至数百个蛋白　 提高了诊断的灵敏度和特异性*蛋白组学研究手段 激光捕获显微切割技术 双向电泳 荧光差异双向电泳系统 SELDI-TOF MALDI-TOF MALDI-Imaging*激光捕获显微切割技术 组织是多种细胞群体相互作用的三维空间结构，但以往的各种技术所获得的细胞，其内既有肿瘤细胞，又多少不等地含有一些其他细胞。 体外培养的细胞系虽能解决组织异质性问题，但其培养环境与组织内环境有一定差距，无法真实反映在体内复杂环境下生长的肿瘤细胞具有的各种特性。 而激光捕获显微切割技术(Lasercapturemicrodissection,LCM)是一项在显微镜直视下从组织切片中确定、分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术，它成功解决了细胞异质性问题，是肿瘤学研究的一项革命性技术。*LCM的基础原理 将制备好的切片放在倒置是微镜载物台上，调整表面贴附一层乙烯乙酸乙烯醋(ethylenevinylacetate,EVA)膜的塑料帽，使其覆于切片的组织表面，并使目的细胞(群)位于视野中心。 发射激光束，瞬间升温使EVA膜局部融化，渗透到目的细胞周围，随即迅速冷却固化，于是EVA膜与其下方的细胞便紧密粘合在一起。 揭起EVA膜，被捕获的目的细胞即和EVA膜一起脱离切片上的其他组织。*LCM的优点 方法快速、简便、易行每片转运膜可经受1000-3000次激光脉冲，捕获6000个以上的细胞。每次激发耗时不超过1秒 准确度高激光定位的准确程度可以达到1um,捕获点范围达到3-5um，因而足以捕获单个细胞， 细胞形态保持完好使用多聚体膜捕获目的细胞，无损伤破坏，保持了其完整的组织形态 细胞内分子结构保持完整转运膜轻微、短暂的温度变化对细胞内DNA,mRNA以及蛋白质均无损伤 特异性强LCM可以从免疫组化染色的组织切片中分离、纯化具有不同抗原表型的细胞群加以研究**双向凝胶(2Dgel)电泳 分离蛋白质最基本的工具。 原理是：第一向是等电聚集电泳：用pH值呈梯度排列的凝胶，分离等电点不同的蛋白质。 第二向是十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)：由于带负电荷的SDS可与蛋白质多肽链结合，掩盖了蛋白质原有的电荷差别，故可分离分子量不同的蛋白质。 双向凝胶电泳不仅用于蛋白质的分离，同时也用于蛋白质的纯化，一张凝胶可分离纯化出几百个甚至上千个蛋白质。**经典蛋白质组研究技术路线样品(组织、细胞等)凝胶图象分析蛋白质鉴定二维数据库酶解HPLC-MS、MS/MS数据库检索二维凝胶电泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指纹谱肽序列标签测序一维SDS-PAGE*ProteomicsAnalysisintheControlandExperimental* 操作强度高，耗时，需要严格控制各种条件 肉眼判断表达强度，误差大 不适应于大规模筛查和临床检测-通量低 低丰度、跨膜蛋白、以及疏水性蛋白很难被分离-分离能力差 胶上的蛋白质斑点很大部分包含一种以上蛋白-分辨率低 在样品制备过程中的蛋白修饰会产生一些假阳性点 高丰度蛋白会掩盖低丰度蛋白的存在 双向凝胶面临的挑战****38个蛋白点的表达存在明显差异,其中新增蛋白点3个,缺失5个,20个明显上调,10个明显下调.* 荧光差异双向电泳系统 凝胶差异蛋白质组分析的金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，是唯一精确定量2D胶差异的技术，显著降低了重复实验和凝胶数量。 这种方法将待比较的两个样品的总蛋白分别用两种不同的荧光标记试剂(Cy3或Cy5)进行标记，并等量混合，上样进行双向电泳分离。 2D凝胶在成像仪上用两种不同的波长激发成像，并用分析软件进行定量分析，对差异的蛋白质点进一步用MALDI-TOF或其他方法鉴定。***TissuesampletypicalorordinaryPTC5matchednormaltissue5normaltissuefrompatients3withbenignadenomas(secondarycontrol).*Proteinsfrompoolsofnon-tumorthyroidtissuefrompatientswithbenigntumors(adenoma)wereconjugatedtoCy3andproteinfrompoolsofnon-tumorthyroidtissuefromPTCpatientswereconjugatedtoCy5.only89(6.3%)of1414spotsweredeterminedtohave≥two-folddifference*Proteinsfrompoolsofnon-tumorthyroidtissuefromPTCpatientswereconjugatedtoCy3,andproteinfrompoolsofPTCtumortissuefromthesamepatientswereconjugatedtoCy5.ProteinsoverexpressedinPTCareshowninred,thoseunderexpressedingreen.628(34.2%)ofthe1840spotsas≥two-folddifferentinvolumeratio* Proteinspots(289)werepickedfromthegel,digestedwithtrypsin,andsubjectedtoMALDITOFMSanalysis. Analysisfocusedon192spotswhichreturnedvalididentifications，representing90distinctproteins. NoveldifferentiallyexpressedproteinsincludeS100A6,moesin,HSP70(BiP),peroxiredoxin2,proteinphosphatase2,seleniumbindingprotein1,vitaminDbindingprotein,andproteinsinvolvedinmitochondrialfunction.**荧光差异双向电泳系统的优点和缺点优点: 可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或不同处理样本的蛋白质表达谱 能在较宽的动态范围内精确地对感兴趣的蛋白质进行定量缺点: 胶内的蛋白质离开荧光成像扫描后便无法显示 未被标记的分子与被标记的分子在凝胶上的位置略有不同,尤其是低分子量的蛋白*ApplicationofMassSpectrometryinCancerDiagnosis*ProteinChipSELDI-TOF(SurfaceEnhancedLaserDesorption/Ionisationtime-of-flight)MS蛋白质飞行质谱仪**SELDI:SurfaceEnhancedLaserDesorption/IonizationProteinChipTechnology:SELDITOF-MSSampleisplacedonaProteinChipArrayandprocessed.Sampleproteinsbindtochemicalorbiological“dockingsites”Non-bindingproteinsarewashedaway,eliminatingsample“noise”.**ProteinChipTechnology:SELDITOF-MS Retainedproteinsare“eluted”fromtheProteinChipArraybyLaserDesorption/Ionization IonizedproteinsaredetectedandtheirmassisaccuratelydeterminedbyTime-of-FlightMassSpectrometryIntensityMolecularMass(Da)DetectorLaserTOF-MS**生物芯片化学芯片疏水芯片阳离子交换金属芯片亲水芯片PS10orPS20抗原-抗体受体–配体DNA-Protein阴离子交换ProteinChip®Arrays蛋白质飞行质谱芯片种类* Au芯片是基于SELDI技术的未经任何化学或生物基团修饰的金属表面芯片，无需前处理可直接点加尿样检测，方法快速简便，干扰因素少，检测成本低(芯片经一定方法清洗后可重复使用)。*SELDI-TOF质谱的技术优势从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获、检测和分析蛋白质,不需任何标记较高的检测灵敏度(1-50fmole的蛋白质)可适用于小样品体积(0.5µl)快速获取实验结果获得蛋白质分子量*BiomarkerDiscoverybyProteinProfiling应用蛋白质表达指纹图谱发现生物标志物 ComparisonofpairedsamplesusingtheProteinChipSoftware Datasetscanbesubtractedtocreatecomparisonmaps,uniqueandup-ordown-regulatedproteinsarereadilyvisualized DatasetscanbecombinedtocreateAveragesofsamples*举例********* 由于质谱蛋白组技术与生俱来的优势：高灵敏度、高通量和高速度，起初大家对此技术持乐观态度，被认为是筛查生物标志物最有力的工具。 利用这一分析模式找寻诊断标志物渐渐受到了质疑，作为一个疾病的早期诊断的标志物，其阳性预示值显然是偏低的，卵巢癌的研究中就存在这样的问题。 这些假设的标志物对于某种肿瘤而言可能并不特异，可能反映的仅仅是疾病的伴随状态。 随后的几年中，SELDI-TOF以及MALDI-TOF在血清或者血浆中寻找肿瘤标志物的应用受到了越来越多的质疑。批评的声音主要集中于以下三个方面：实验设计，质谱技术以及生物相关性。SELDI-TOF缺点**实验设计 大多数的研究仅仅比较两组不同的样本肿瘤标志物为急性时相反应蛋白？ 模型出现过度拟合的现象 样本量偏小*****质谱技术 血清（血浆）中的成分的微小变异会影响信号的强度。标本中的成分也会影响某种蛋白质电离的有效性。事实上即使某种分子即使在两个样本中浓度相同，只要这两个样本的组成成分有所差异就会导致得到的信号的强度有所不同。 另外使用SELDI-TOF或者MALDI-TOF技术无法对候选的标志物进行直接鉴定。这样假阳性信号（急性时相反应，人工修饰造成的影响等）就无法去除。更有甚者，这些假阳性信号可能在比较质谱结果时被鉴定为标志物。为了能克服这个问题，串联质谱检测和／或后续的纯化就显得十分必要了。SELDI-TOF技术尤其受到质疑，使用不同批次的芯片得到的质谱之间的差异、基线漂移以及噪音等都会降低检测结果的重复性。*数据的生物相关性 血液中的不同蛋白质的浓度至少相差10个数量级，范围从白蛋白（35-50mg/ml）到IL-6(0-5pg/ml)。血浆中97%的蛋白质由下列七种主要的高丰度血浆蛋白质构成：白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、1-抗胰蛋白酶、2-巨球蛋白、转铁蛋白和脂蛋白。剩下的3%的蛋白质是一些中低丰度的蛋白质的混合物。 现行的质谱仪能检测的蛋白质的动态变化的范围（通常能检测2-3个数量级范围）不足以包括血液标本中的所有蛋白质。特别当疾病只累计很少的一些细胞时，血液中特定疾病所造成的组织释放的蛋白质的浓度常常太低导致无法被检测出来。这些高丰度的蛋白质常常能掩盖那些浓度低几个数量级的蛋白质所发出来的信号。而且，当非特异性的结合物质（例如树脂材料），用来捕获样本中的蛋白质，高丰度的蛋白质往往会竞争和干扰低丰度的蛋白质的结合。而且一个低丰度的蛋白质的光谱信号的强度，可能仅仅因为血液中其他成分的存在而显示出差异。 循环血浆中蛋白质浓度因为一些因素而造成的内在变异而发生变化，例如个体的基因背景、性别、年龄、营养状态和生活方式（包括吸烟和饮食）、用药情况、以及其他一些因素。当然血液标本的收集过程也会影响最后的质谱的结果，如采集标本时的体位，或者使用止血带都会影响检测结果。标本的储存条件也影响血浆或者血清中的微量蛋白的稳定性，这一点也已经得到证实。*其他 无法对潜在的标志物进行鉴定。虽然，质谱技术找到的差异蛋白峰可以作为标志物，但是如果能实现进一步的鉴定有很多优点。首先，这能为设计单独实验来验证质谱的结果提供一种可能（例如ELISA）。这些替代实验可能耗费更低并且更容易在临床检测中运用。而且，如果鉴定出这些差异的蛋白质，那么就非常清楚地知道这些分子可能非特异性还是特异性的标志物。对蛋白质的鉴定有利于正确的样本分组，为研究的疾病提供相关的生物学信息。 发现新标志物的研究的一个重要障碍是如何有效地评估这些潜在标志物的临床意义。没有独立的、多中心的、大型临床验证试验，将无法评估这些标志物是否能真正有效地用于疾病的诊断或者治疗监测的指标。***Alpha-defensin家族是由一组具有抗微生物、细胞毒、抗肿瘤活性的短肽组成,分为主要存在于中性粒细胞和肠道Paneth细胞中。是一非肿瘤特异的，应激状态的蛋白。*“Serum/plasmaproteomicpatternsobtainedbySELDImaynotbereproducibleandthatthediscriminatorypeaksarenotconsistentwithinagrouporamonggroupsofinvestigatorsforthesametypeofcancer,evenwhenthegeneralanalyticalmethodsordatasetsarethesame.” Samplepreparationforserum/plasmaprofilingandbiomarker　identificationbymassspectrometry　JournalofChromatographyA,1153(2007)259–276*患者血清样品磁珠分离过程数据分析临床结果疾病正常正常BindingWashingElutionMALDITOF检测Clinprot检测流程健康人*ThefutureofClinicalProteomicsistotakeblood,urineortissueandrunthesesamplesthroughascreeningsystemwhichwillultimatelyactasadiagnosticforearlypredictionorpredispositiontoconditions.*液体芯片工作原理*ClinProt磁珠试剂盒疏水作用MB-HIC1MB-HIC3MB-HIC8MB-HIC18鳌合金属亲和MB-IMAC-FeMB-IMAC-Cu离子交换MB-WCXMB-WAX糖蛋白试剂盒G蛋白试剂盒*2079220427483260m/z2079,2204,2748,3260NormalCancerClinPortAnalysisofHumanPlasmaSamples*观察差异峰Class1Class2生物信息数据处理软件-ClinProTools**Clinprot的优势*超高灵敏度的质谱仪：fmol级，适合肿瘤早期微量蛋白的发现。◆样品靶上加有疏水作用基团，中央是亲水基团，在溶剂蒸发时，收缩样品液滴集中在中央，可大大增加单位面积样品的浓度◆相对常规芯片，提高10-100倍的灵敏度◆一块芯片有96点，处理量较一　　　　　般的芯片更大！优势一：灵敏度高*优势二：重复性好示例：某实验对比三个蛋白峰的重现性 0.0119 9278.5 0.0096 7760.0 0.0089 5902.9 CV Mean Location(n=4) 3 2 1 Bruker Peak Platform*每次检测只需5μl血清滴血验癌优势三：血清用量少*优势四：磁珠种类多、适于各类临床样品疏水作用MB-HIC1MB-HIC3MB-HIC8MB-HIC18离子交换MB-WCXMB-WAX鳌合金属亲和MB-IMAC-FeMB-IMAC-Cu临床样品：血清、血浆、尿液、脑脊液、羊水、唾液等。*优势五：样品处理通量高　手动处理，每次可处理96个样品利用机械臂每天可处理高达3万个样品*美国斯隆-凯特琳癌症研究所2006年2月第6卷NatureReviewsPaulTempst应用液体蛋白芯片指纹图谱仪对前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌进行血清多肽指纹谱图研究，其中对前列腺癌的盲性预测准确率达100％。**LisaH.Cazares,ShaminaMitchell-Green,Sau-MeiLeung,BrendanC.StackJr.,J.TradWadsworth,RichardR.Drake,andO.JohnSemmesDepartmentsofMicrobiologyandMolecularCellBiology,Otolaryngology-HeadandNeckSurgery,EasternVirginiaMedicalSchoolNorfolk,VA应用实例头颈部鳞状细胞癌生物标志的发现与鉴定*实验目的与方案： 头颈部鳞状细胞癌在美国占所有癌症的5%。 寻求早期诊断头颈部鳞状细胞癌的生物标记物。 血清样品：24名患者，24健康对照。 亲和性IMACCu磁珠盒。*头颈部鳞状细胞癌生物标志的发现*PeptideViewMS/MSFragmentationofDSGEGDFLAEGGGVRFoundingi|229185,fibrinopeptideAStart-EndObservedMr(expt)Mr(calc)Delta2-161465.721464.721464.650.07SequenceDSGEGDFLAEGGGVRMatchedpeptidesshowninBoldRed1ADSGEGDFLAEGGGVRC.B.1469.091868.21208.21619.02675.61352.51780.82024.52557.22297.601234x10Intens.[a.u.]12001400160018002000220024002600m/zA.(A)Serumprofilewasgenerated(B)MS/MSspectrumforapeptideatm/z1469.09(C)FibrinopeptideA,withaMowsescoreof57头颈部鳞状细胞癌生物标志(质量m/z1469Da)的鉴定--MALDITOF/TOF技术的应用*MALDI-IMAGING 基质辅助激光解吸电离（matrixassistedlaserdesorptionionization，MALDI）质谱成像技术最早由Caprioli等于1997年通过将MALDIMS离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比（m/z）化合物的二维离子密度图（two-dimensionaliondensitymaps），对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析。*MALDI质谱分子成像的原理 MALDI质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片，接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品，利用MALDI系统的质谱成像软件，选择拟成像部分，首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵，来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件控制开始采集质谱数据，在质谱仪中，激光束对组织切片进行连续的扫描，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比（m/z）信息，然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。**MALDI质谱分子成像的技术操作流程 1.组织制备在组织切片前，切除的新鲜组织立即置液氮中冷冻2～3分钟后，在恒温冷冻切片机上进行切割，切割平台的温度根据组织类型保持在-5到-25℃之间，如高脂肪含量的组织就要求更低的温度。切片厚度一般在5到12μm，保证质谱分析时足够的组分浓度。组织切片的优劣是影响图像质量的关键因素之一。切片制备需要满足以下几个条件：防止形成冰晶，维持化合物的空间排布，避免分析物的移位和降解；避免切片打卷、起皱褶；适宜的切片厚度等* 2.覆盖基质常用的基质有3，5-二乙氧基-4-羟基肉桂酸（又称芥子酸，SA）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）和2，5-二羟基苯甲酸（DHB）。其中，SA主要适用于高分子量的蛋白；HCCA适用于多肽和低分子量蛋白，DHB主要适用于小分子药物。在ImagePrep工作站，在可控条件下振荡蒸发产生基质微粒，然后轻柔的置于组织样品之上。基质溶液在均匀地覆盖于组织切片表面的过程中，要尽可能满足以下几个条件：组织切片上的蛋白无扩散或移位现象；基质与蛋白形成良好的共结晶；晶体的尺寸必须小于质谱成像的分辨率。* 3.质谱的获得良好质谱的获得依赖于所使用的质谱仪，Smartbeam技术则将N2激光和YAG激光相结合，可获得较好质量和较高重复性的质谱，空间分辨率为10µm，可获得200Hz激光频率的谱图，其XY平面的精度为5µm。* 4.成像数据分析采用软件将选定质量、质量范围或重叠在显微图像上的质谱群的强度分布可视化，分析不同种类生物分子的空间分布，如多肽、蛋白或小分子等，峰的强度可用色彩饱和度来表示。有一些专业软件，如ClassImaging可通过组织生物标志物的多变量统计分析，自动化分类组织的分子状态。* 未经包埋的冷冻组织； 常规切片（10-20微米）； 组织切片放置在导电玻璃上，用乙醇清洗除去盐和脂； 切片表面喷基质用于MALDITOF测定。 同时备有未喷基质的切片用于组织染色。MALDI分子成像技术–样品制备*导电玻璃片样品靶基质喷瓶MALDI分子成像技术–样品装置*放置组织切片的导电玻璃片可直接放入MALDITOF质谱仪中测定：从组织到成像**flexImagingSoftwareMeasuringareasResultfilterImageofsampleandresult**SpatialResolutionMicroscopicImage63µmletterburnedinto400µmPACcalibrationspot.MALDIImage(m/z1297Da)SmartBeamLaserspotsize about10µmStepsize 5µm TechnicallimitofUltraflexIIwithsmartbeam(changeablefocus)~5to10µmCurrentpracticallimitontissue~30–40µm(duetomatrixpreparation)**MALDI质谱分子成像的特点 无需事先知道所研究疾病或药物相关生物分子的信息，而且不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，同时可对这些蛋白质分子含量进行简单的定量，为寻找、阐明和鉴定重要蛋白提供了更快分析结果以及可视化结果。 通过组织样品以扫描的模式捕获谱图，即可提供代表多肽、蛋白质、代谢物或其他分子的质谱信号，这些数据产生的彩色图像完全可以取代显微镜图片。 获得图像不需要对组织中的生物分子进行标记或染色，操作方便和简单。 高通量：同时根据蛋白指纹图谱（肽指纹图谱）鉴定成百上千的蛋白质并观测感兴趣的目标蛋白在组织和细胞中的分布。⑤高兼容性：可直接以组织切片或细胞（细胞团）进行分析。⑥高灵敏度：可分析含量低至amol的调节蛋白，如蛋白质的各种异构体、不同修饰状态和不同的代谢片段。* 基于以上特点，MALDI质谱分子成像技术可以在药物研发过程中，在分子水平上监测药物的有效性，如当药物被用于疾病组织，就可检测组织样品外形的变化，跟踪特定药物在靶体组织中的定位即空间分布，揭示化合物是如何在不同组织中发挥作用的。 在临床蛋白质组学研究中，MALDI分子成像能够在疾病进程中，在组织中研究潜在生物标志物的空间分布以及表达的上调或下调，在诊断、癌症病程监控、外科切除有效性评价中具有重要价值。MALDI质谱分子成像的应用*LisaH.Cazares,ShaminaMitchell-Green,Sau-MeiLeung,BrendanC.StackJr.,J.TradWadsworth,RichardR.Drake,andO.JohnSemmesDepartmentsofMicrobiologyandMolecularCellBiology,Otolaryngology-HeadandNeckSurgery,EasternVirginiaMedicalSchoolNorfolk,VA应用实例头颈部鳞状细胞癌生物标志的发现与鉴定*胃癌差异蛋白ReferencesectionHematoxylin/EosinstainedMALDI-ImageMatrixdeposition:SmalldropletsSamplecourtesyof:C.Röcken,PathologyM.Ebert,GastroenterologyUniversityofMagdeburg*不同颜色代表不同蛋白/多肽的分布MALDITOF组织成像－大鼠脑组织*不同颜色代表不同蛋白/多肽的分布MALDI分子成像－大鼠脑组织**m/z7054,7943and20026LensprovidedbyKSchey,MedicalUniversitySouthCarolina不同颜色代表不同蛋白/多肽的分布MALDI分子成像－牛眼球晶状体**Chaurandetal.AJP2004,165(4)**** 快速直观的发现组织中的生物标志物。 在临床病理诊断中克服了人为因素，医生,有可能用真实的数据来评判病情。 同时可分析数千个蛋白(不论其抗体是否可得到)病理组织染色领域的一个新里程碑。 可分析小分子物质(药物或代谢物)。 为医学临床诊断学的研究提供了一个具有前瞻性的医学平台。MALDI分子成像技术优势*蛋白质的鉴定 组织切片经MALDIMS分析获得的质谱图经处理（如消除背景、高斯平滑及校准刻度等）和统计学意义分析后，鉴定出组织中差异表达的质谱峰，将所有的差异峰归属到列表中（按m/z排列），这些差异峰所对应的蛋白质或多肽可能在疾病发展进程中起到显著的调节作用。 从二维离子密度图像中得出这些蛋白质在组织中的精确位置，切取该区域组织，匀浆后提取分离蛋白质，蛋白质提取物由高效液相色谱分离，采用电喷雾（ESI）质谱定位目的蛋白并收集纯化馏分；或者由一维电泳进行分离，根据胶上标准蛋白的分子量对目的蛋白进行定位。然后进行酶解，质谱分析和数据库查询从而鉴定蛋白质。 通过免疫化学等方法，采用特异的抗体对鉴定的蛋白质进行验证。*PerspectiveandFutureapplications Identifyingthesiteoforiginfortumor Rapidevaluationofsurgicalmargin Measuringsusceptibilityandresponsetotherapeuticagentsintumorandsurroundingtissues****血浆蛋白组学面临的挑战 ComplexityoftheProteomeandPeptidometotally9504proteins,3020proteinsidentifiedasCoreProteinDatasetforPlasmaProteomeProject DynamicConcentrationRangeofProteinsinPlasma 1012-foldconcentrationrange,farexceedingthedynamic rangeofmostanalyticalmethods Standardizationandthoroughunderstandingofpreanaly-ticalfactors,includingpatientpreparationandspecimencollectionandprocessingtechniques,areurgentlyneeded.* ExperimentaldesignBasedonthecomparisonofonlytwogroupsofsamples;inadequatealgorithm;lackofqualitycontrolofthespectra MassspectrometrytechniquesVariablesaffectingtheintensity;unablingofdirectidentification;usingdifferentbatchesofchip PhysiologicandclinicalrelevanceofthedataobtainedDynamicrangeofprotein;alowabundantprotein,interferingofhigh-abundanceofprotein;intrinsicvariabilityBiomarkerdiscoveryfrombodyfluidsusingmassspectrometry*Effortstoimprove EffortstoimprovethereproducibilityofthespectraTheprotocolemployedtopreparethesampleandspectrometerconditionsduringacquisition EffortstoincreasethedynamicconcentrationrangeSelectivedepletionofthemostabundantproteinsandthefractionation Applicationofmethodologiesthatallowproteinand/orpeptidequantitationDifferentialisotopiclabellingandspikingthesampleswithareferencematerial IdentificationofthehumanplasmaproteinsandgenerationofadequatedatabasesNon-informativesignalscan’tnotfiltered.Theconstructionofgoodplasmadatabasesmayalsofacilitatethedesign.***CommentsandQuestion?guanming88@yahoo.com***ThefutureofClinicalProteomicsistotakeblood,urineortissueandrunthesesamplesthroughascreeningsystemwhichwillultimatelyactasadiagnosticforearlypredictionorpredispositiontoconditions.******