硼替佐米对伯基特淋巴瘤Raji的体外治疗作用

硼替佐米对伯基特淋巴瘤Raji的体外治疗作用李靖1，闫明显21.河南省洛阳职业技术学院，河南洛阳，4710022.河南科技大学第一隶属医院，河南洛阳，471002纲要：【目的】探究硼替佐米对伯基特淋巴瘤Raji细胞体外治疗作用及其可能体制。【方法】MTT实验检测硼替佐米对淋巴瘤Raji细胞活力的影响；Westernblotting实验和RT-PCR实验检测硼替佐米对Raji细胞中NF-κBp65表达和Caspase-3剪切的影响。【结果】MTT实验表示硼替佐米抑制Raji细胞活力，并且其抑制作用呈剂量、时间依靠性（P<0.05）；Westernblotting实验和RT-PCR实验显示硼替佐米显著抑制Raji细胞NF-κBp65表达并且促进caspase-3的剪切（P<0.05）。【结论】硼替佐米能够抑制Raji细胞增殖，体制可能与抑制NF-κB（P65）激活和上调cleaved-caspase-3表达有关。【重点词】硼替佐米；淋巴瘤；NF-κBThetherapeuticeffectofBurkittbortezomibonlymphomaRajiinvitroLiJing1,YanMing-ming21:LuoyangVocationalCollegeofTechnology,Luoyang471002,China2:FirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471002,ChinaAbstract:Objective:ToexploretherapeuticeffectofbortezomibonBurkittlymphomaanditspossiblemechanism.Methods:TheeffectofbortezomibonhumanlymphomaRajicellsproliferationwasdeterminedbyMTTassay.TheexpressionofNF-κBp65andCleaved-caspase-3proteinweredetectedbyWesternblotting.NF-κBp65andCleaved-caspase-3mRNAexpressionweredetectedbyRT-PCR.Results:ThedatashowedthatbortezomibinhibitedRajicellsproliferationandtheinhibitionratewererelatedinadose-dependentmannerandatime-dependentmanner(P<0.05).WesternblottingdataindicatedthattheexpressionofNF-κBp65wasdecreasedandtheexpressionofCleaved-caspase-3wasincreasedafterbortezomibtreatmentinadosedependentmanner(P<0.05).RT-PCRdatademonstratedthatthemRNAexpressionofNF-κBp65wasdecreasedandthemRNAexpressionofCleaved-caspase-3wasincreasedafterbortezomibtreatmentinadosedependentmanner(P<0.05).Conclusions:BortezomibcaninhibitRajicellsproliferationmayviadownregulatingtheexpressionofNF-κBandupregulatingtheexpressionofCleaved-caspase-3.Keywords:Bortezomib;lymphoma;NF-κB伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma,BL)，属于B淋巴细胞性的非霍奇金淋巴瘤（NHL），常发于儿童和青少年，很少在中年人群中发现[1]。70%-80%高速增殖的BL发生染色体易位[2]，染色体易位致使致癌基因和c-Myc基因过表达以及组成性激活，致使细胞形状转变，细胞增殖失控[3]。当前，BL化疗包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、阿糖胞苷和利妥昔单抗针对性治疗，虽然在儿童患者取得了一定的治疗效果，但是对青少年患者来说依旧存在预后较差现象[4,5]。因此需要有更有效的化疗药物提高淋巴瘤的治疗效果。异样NF-κB激活以及促增殖和抗凋亡基因的高表达，是多种恶性淋巴瘤主要特点之一，如霍奇金淋巴瘤与非霍奇金淋巴瘤，洋溢性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。有研究证实，NF-κB参与调控B、T淋巴瘤细胞增殖基因[6]激活，且与淋巴细胞发生、发展和增殖有关cyclinD1和c-Myc[7]。此外，c-Myc和抗凋亡基因(Bcl-2,Bcl-xL)能够经过NF-κB信号途径抑制免疫系统致使伯基特淋巴瘤免疫缺陷[8]。这些研究暗示以NF-κB为靶标的药物可能用于治疗伯基特淋巴瘤。硼替佐米（Bortezomib，BZ）是FDA第一个批准的蛋白酶体抑制剂，能够经过抑制IκBα降解，进而抑制转录因子NF-κB的激活和转位[9，能够用于套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗[10]。但是硼替佐米治疗伯基特淋巴瘤的作用和体制尚未完全认识了硼替佐米对人淋巴瘤细胞株Raji细胞的增殖的影响及其可能的体制。1实验内容[11]。因此，我们研究1.1主要试剂人淋巴瘤细胞株Raji细胞购自AmericanTypeCultureCollection，RPMI-1640培养基购自美国Sigma企业，胎牛血清（FBS）购自美国Invitrogen企业，NF-κBp65抗体、Cleaved-caspase-3抗体和GAPDH抗体均购自美国SantaCruze企业，抗兔和抗鼠二抗购自江苏碧云天生物研究所。1.2引物NF-κBp65、cleaved-caspase-3和GAPDH引物由上海生工生物企业合成，NF-κBp65引物序列：forward：5’-GTTCACAGACCTGGCATCCGT-3’，reverse：GAGAAGTCCATGTCCGCAATG-3’；Cleaved-caspase-3引物序列：forward5’-：5’-GTTTGAGGACCTTCGACCAG-3’，reverse：5’-CAAAGATGTCGTCCAGGGTC-3’；GAPDH引物序列：forward：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，reverse：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。1.3细胞培养人淋巴瘤细胞株Raji细胞培养于37℃、含有5%CO2饱和湿度培养箱中，其培养基是含有10%FBS的RPMI-1640培养基，并且向培养基加入青霉素-链霉素双抗。分别向Raji细胞培养基中加入生理盐水溶解的硼替佐米，硼替佐米最终浓度分别为0、5、10、20和50nmol/L（nM）1.4方法1.4.1MTT方法检测Raji细胞株活力将Raji细胞接种到96孔板中，每孔接种1×104个Raji细胞，在37℃、含有5%CO2饱和湿度培养箱中培养24h后，分两组实验。一组与不同浓度硼替佐米（0、5、10、20和50nM）共同孵育24h，每个浓度设置4个复孔；此外一组是用10nM硼替佐米与Raji细胞分别孵育24h、48h和72h，每个时间点设置4个复孔。之后每个组加入20μlMTT工作液，在培养箱内持续培养4h，吸出培养基，加入200μlDMSO，摇床摇摆10min充分溶解结晶物。将96孔板盖翻开，放入酶标仪检测，在波长490nm处检测OD值，并做记录。，以上实验重复3次。1.4.2Westernblotting实验按照实验要求用不同浓度硼替佐米（0、5、10、20和50nM）办理Raji细胞24h后，PBS洗涤细胞，加入细胞裂解液RIPA（其中含有蛋白酶抑制剂1:1000），冰上裂解30min，收集蛋白。离心（4℃，12000×g/min）15min。BCA蛋白定量试剂盒定量后调整各组蛋白上样总量至30μg。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别蛋白，电转到PVDF上。室温5%牛奶关闭1h。TBST洗膜3次，每次5min。加入NF-κBp65抗体(1:2000稀释)、Cleaved-caspase-3抗体(1:1000稀释)和GAPDH抗体(1:5000稀释)4℃下孵育留宿。TBST洗膜3次，每次5min。孵育相应的二抗(1:1000稀释)，TBST洗膜3次，每次10min。加ECL发光液显影，用自动显影仪显影，并剖析条带灰度。用自带软件扫描灰度值。1.4.3RT-PCR检测按Invitrogen企业试剂盒 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 从Raji细胞提取总RNA，酶标仪测定样品在260nm和280nm处吸光度(OD)，并进行核酸定量。每个反响管加总RNA2μg，总反响体系20μl，反响条件：42℃，20min；99℃，5min；4℃，5min。PCR扩增体系：10×反响缓冲液10μl，cDNA20μl，forward引物1μl，reverse引物1μl，Taq酶1μl，ddH2O27μl。扩增条件:94，60s；60℃（(NF-κBp65）58℃（Cleaved-caspase-3），30s；72℃，60s；进行32个循环。然后72℃，10min，4℃保留。取上述扩增产物10μl，1.5%凝胶电泳在100V电压下电泳1h。凝胶成像系统显影并扫描灰度值。1.5统计剖析所有实验数据采用SPSS20.0进行统计学剖析。实验结果以均数多组数据采用单因素方差剖析（ANOVA），并用BonferroniP<0.05表示差别有统计学显著性。 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差（meanSD）表示，法进行均数组间的两两比较，以2结果2.1MTT实验检测Raji细胞活性MTT实验结果显示，不同浓度硼替佐米对Raji细胞有显著抑制作用（P<0.05），同一浓度不同时间对Raji细胞也有显著抑制作用（P<0.05）。见图1.图1MTT实验检测硼替佐米对Raji细胞活性影响。A不同浓度硼替佐米与Raji细胞孵育24h后，经过MTT实验检测其活力（n=3，*P<0.05）。B10nM硼替佐米与Raji细胞孵育不同时间后，经过MTT实验检测其活力（n=3，*P<0.05）。2.2Westernblotting实验剖析目的蛋白Westernblotting实验结果表示随着硼替佐米浓度增加，NF-κBp65表达减少，Cleaved-caspase-3表达增加（P<0.05）。见图2.图2Westernblotting实验剖析目的蛋白。（n=3，*P<0.05vs0nM）。2.3RT-PCR检测硼替佐米对Raji细胞中RT-PCR检测结果表示在硼替佐米抑制NFκBp65和Caspase-3mRNA的影响。Raji细胞增殖时，陪伴着NF-κBp65mRNA下调以及Cleaved-caspase-3mRNA上调，并且呈剂量依靠性（P<0.05）。见图3.图3RT-PCR检测硼替佐米对Raji细胞中NF-κBp65和Cleaved-caspase-3mRNA的影响（n=3，*P<0.05vs0nM）。议论传统化疗占有肿瘤疾病治疗的砥柱中流，但好多化疗药物对肿瘤治疗效果并不尽人意，且还经常发生毒副作用和耐药性，进而妨碍药物的临床使用。蛋白酶体是多蛋白复合物，对泛素降解起着重要的作用[12]。有报道阐述，蛋白酶体活性异样会增加内质网压力，最终引起肿瘤细胞凋亡[13]。因此，抑制蛋白酶体活性已经成为研究肿瘤治疗新的方向[14]。硼替佐米是二肽硼酸蛋白酶体抑制剂，拥有扰乱DNA修复、诱导细胞凋亡的作用。本研究发现硼替佐米对Raji细胞活力有显著抑制作用，并且拥有浓度和时间依靠性。进一步，研究发现，硼替佐米能够下调Raji细胞中NF-κB蛋白和mRNA表达，上调Cleaved-caspase-3蛋白和mRNA表达，均拥有浓度依靠性。NF-κB是转录因子蛋白家族，参与调控机体免疫应答、炎症反响甚至肿瘤发生进展等多种生命进度。而NF-κB异样转位，会致使调控失衡。众多研究发现，在肿瘤细胞凋亡时，NF-κB转录受到抑制[3,15]。本研究初步表示，硼替佐米可能经过抑制IκBα降解，进而抑制转录因子NF-κB的激活和转位，最终促进caspase-3剪切，最终抑制Raji细胞增殖，进而起到治疗淋巴瘤作用。参照文件IsraelsT,vandeWeteringMD,HesselingP,etal.MalnutritionandneutropeniainchildrentreatedforBurkittlymphomainMalawi[J].PediatrBloodCancer,2009,53(1):47-52.DangCV,O'DonnellKA,JuopperiT.ThegreatMYCescapeintumorigenesis[J].CancerCell,2005,8(3):177-178.孙晓非,甄子俊,刘冬耕,等.改进B-NHL-BFM-90 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 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