荧光原位杂交检测宫颈脱落细胞hTERC基因实验方法比较观察

荧光原位杂交检测宫颈脱落细胞hTERC基因实验方1=FA法比较观察[11-02-1314:47:00]作者：曾蓉蓉，金松编辑：studa20【摘要】U的：探讨荧光原位杂交技术检测端粒酶基因(hTERC)实验方法的最佳方案。方法：采集海医附院收治的140例患者的宫颈脱落细胞，分别应用液基取材刷、无菌棉签取材法;生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种制片方法;水浴和直接消化法；屮酰胺法和共变性法，通过检测宫颈脱落细胞hTERC基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达成功率,对比实验方法的最佳方案。结果：取材方法中液基取材刷与无菌棉签的细胞数量满意率分别为95.5%.14.3%,2种方法差异有统讣学意义(P<0.05);生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种方法杂交成功率分别是80.0%.84.8%.46.2%.82.1%,其中直接取液滴片与其他法差异有统计学意义(P〈0・05),其他方法之间比较差异无统计学意义(P>0.05);2种消化法中水浴和直接法杂交成功率分别为88.9%.94.1%,差异无统计学意义(P>0.05),杂信号比例分别为16.7%.45.6%,差异有统计学意义(P<0.05);2种变性法中屮酰胺法和共变性法杂交成功率分别为72.3%、96.0%,差异有统计学意义(P<0.05)o结论：荧光原位杂交技术检测宫颈脱落细胞hTERC基因时，以液基取材刷取材细胞数量多，TCT低渗方法制片效果最好，水浴法和共变性杂交成功率最高。【关键词】荧光原位杂交;宫颈脱落细胞；TERC基因[ABSTRACT]Objective:ToinvestigatetheoptimalmethodsoffluorescenceinsituhybridizationonhTERCgenedetection.Methods：140samplesofcervicalexfoliatedcellsweregatheredbyfluidbasebrushsamplingandasepticcottonsamplingintheAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege;moviesweremadebyphysiologicalsalineinfiltration,TCTinfiltration,directdroppinganddirectTCTinfiltration.Allexperimentalmethods,bathanddirectdigestion,formamideanddenaturationlaw,werecomparedbydetectingthesuccessexpressionofcervixcastoffcellshTERCgene・Results：Insamplingmethods,thesatisfactoryrateofcellquantityinfluidbasebrushandasepticcottonwere93.5%and14・3%(P〈0・05):Inhybridizationtechnique,thesuccessrateof4methodswere80.0%,84.8%,46.2%,82.1%,respectively,comparedtodirectdroppingmethod,otherthreemethodswerepreferable(P<0.03)andwithnodifferencesamongthem.Intwodigestmethods,thesuccessrateofhybridizationwere88.9%and94.1%,respectively,andwithnodifference(P>0・03)・Buthybridizationsignalratiowere16.7%and45.6%,withsignificantdifference(P<0・05)・Intwodenaturationmethods,thesuccessratewere72.3%and96.0%,withsignificantdifference(P<0・03)・Conclusion：DetectinghTERCgenebyfluorescenceinsituhybridization,fluidbasebrushisbettersamplingofquantitycells,TCTinfiltrationispreferableinmakingmovies,bathandhybridizationvariabilityhavehighersuccessrate.[KEYWORDS]Fluorescenceinsituhybridization;Cervicalexfoliatedcells;TERCgene随着分子生物学的发展，人们运用荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技术检测宫颈脱落细胞中3号染色体长臂26.3位点端粒酶基因（humantelomeraseRNAcomponent,hTERC）的扩增，发现它与宫颈病变有着密切的关系[1]。FISH的原理是以已知的标记单链核酸为探针，按碱基互补原则，与待检材料中未知单链核酸进行结合，形成荧光显微镜下可检测的荧光信号，本实验从取材、制片、消化、变性4个方面，探讨实验方法对FISH杂交率的影响。1材料与方法1.1材料来源收集2007年11月〜2009年3月在海南医学院临床附属医院就诊的140例妇科患者的宫颈脱落细胞标本（排除严重内科疾病及生殖系统炎症）。1.2方法FISH检测均以细胞学检查和组织病理学结果为参照 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。1.2.1取材（1）液基取材刷：患者取膀胱结石位，暴露宫颈，干棉签擦拭分泌物，使用一次性TCT毛刷插入宫颈口，在宫颈外口鳞柱状上皮交界处，以宫颈外口为中心，均匀按顺（逆）时针旋转5周，停留10s左右，将宫颈刷置于TCT液基中保存；（2）无菌棉签：取材方法同前，棉签放于生理盐水中保存。1.2.2制片（1）生理盐水低渗：将生理盐水细胞储存液充分震荡10min,放置1〜2min后取10mL细胞储存液，1500r/min离心10min,去上清，如细胞少，可再取更多液体。加5mL胶原酶B,37°C水浴30min,间断吹打，离心，加5mL去离子水37°C水浴20min,加入2mL固定液（冰乙酸:甲醇=1:3）固定10min,离心后弃上清，吹打悬浮细胞，重复2次固定，取适量密度细胞悬液10»L用移液器滴片。（2）TCT低渗：胶原酶B20min,去离子水40min,其余处理同生理盐水法。（3）直接取液滴片：取10mL细胞储存液，1500r/min离心10min,去上清，滴片同前，滴片后用95%乙醇固定10min。（4）TCT直接低渗：不加胶原酶B,余同TCT低渗。4种方法制片后均自然干燥，室温下过夜老化。1.2.3消化（1）水浴法：37°C0.01mol/LHC140mL加胃酶20mg/mL取80uL,10min;（2）直接法：室温下于玻片中细胞圈上直接加10uL胃酶20mg/mL,10So1.2.4变性探针由北京金菩嘉医疗科技公司提供,为hTERC/CSP3DNA探针，杂交到3号染色体3q2613,荧光信号为红色（四甲基罗丹明）,CSP3作为对照探针，荧光信号为绿色（细胞绿）。变性：（1）中酰胺法：70%屮酰胺2XSSC液（75°C）水浴中变性3min,然后立即-20°C乙醇梯度脱水各3min,自然干燥后,46°C烤片机烤干等待杂交，将配制的探针混合液（杂交混合液7UL、3号探针2UL、去离子水1»L）变性后加于玻片上，封片，入湿盒；（2）共变性法：探针混合液加至细胞圈上盖上盖玻片，封片，置于80°C铁盒内（提前加热，保持干燥），将湿盒置于42°C恒温孵箱中过夜杂交。min,min,1.2.5洗涤观察将杂交后的玻片置于46°C50%酰胺/2XSSC液洗3次（10min）,2XSSC液（10min,46°C）、NP40洗5min（46°C），洗涤完毕后，将玻片置于70%乙醇中3min,自然干燥后，加10uLDAPI,加盖玻片，暗处放置10〜20min;荧光显微镜下观察。1.3判断标准（2）细胞分散度：满意：细胞分布均匀，平铺，重叠否则为不满意。（3）玻片背景：背景清晰，细胞碎片、黏液包裹少为满意，否则为不满意。（4）细胞核形态:核小，过大破裂均为不满意。1.3.1制片 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 标准（1）细胞数量：采用细胞计数板，每张玻片至少1000个细胞以上为满意。少，聚集少，密度适中，炎症细胞量、红细胞数、细胞核形态正常为满意，1.3.2消化判断标准（1）满意：细胞核完整，饱满，实亮，胞浆稀薄，无黏液包裹，背景干净；（2）不满意：太过：核破裂，空洞，核膜呈锯齿状，核虚而分散稀薄，背景呈星空状;不及：胞浆紧实，有黏液包裹，DAPI进入核区困难，核染色浅淡，红、绿通道下无法显示细胞核轮廓。1.3.3FISH成功判断（1）杂交率：每张涂片可观察200个细胞完整信号，完整信号细胞数/总细胞数X100%,少于200个则为失败；（2）信号强弱：荧光信号较强、红绿信号均清晰可辨为满意，荧光信号弱、不能观察计数或红绿信号缺失为不满意。1.3.4结果判断本实验室根据20例正常宫颈脱落细胞建立的阈值4.45%为标准，计数100个细胞大于4个异常扩增的样本则为阳性，反之为阴性。正常细胞表现为红色：绿色信号二2:2（个），如红色信号多于2则为异常细胞（红信号表示hTERC基因，绿信号为着丝粒）。1.4统计学处理采用X2检验，检验标准a=0.05o