PCR的种类及应用

PCR的种类及应用序**PCR的历史操作过程引物步骤PCR的各种变体PCR的应用鉴定基因亲子鉴定诊断遗传病克隆基因诱变 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 远古DNA鉴定特定 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型的突变体基因比较基因表达量目录**PCR这项技术是由凯利·穆利斯(KaryMullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。PCR历史*DNA的复制DNA在复制时，双链DNA解旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链(leadingstrand)；另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(laggingstrand)。**①5’→3’的聚合作用：不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性：切除受损伤的DNA，可用于切口平移（nicktranslation).大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。DNA聚合酶TaqDNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌，能在70-75℃生长.存在于水生嗜热菌(Thermusaquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.TaqDNA聚合酶**PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增。它可以在试管里建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的基因或者某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称为无细胞的分子克隆法。PCR的定义PCR操作过程1、预变性（Initialdenaturation）．　　模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。　　2、引物退火（Primerannealing）　　退火温度一般需要凭实验（经验）决定。　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。　　3、引物延伸　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。　　延伸时间随扩增片段长短而定。　　4、循环中的变性步骤　　循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：　　变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。　　5、循环数　　大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特炖条带　6、最后延伸　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 设计引物可以采取以下原则：GC所占比例为40％－60％两个引物的Tm，相差小于5℃，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过10℃。黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃，但是要根据经验为不同条件下的PCR选择不同的黏合温度。内部的具有自身互补性的发卡结构不超过4个，其二聚体中不超过8个。3‘末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。倒数第二个最好是G/CPCR的各种变体反向PCR(InversePCR,IPCR)不对称PCR(asymmetricPCR)多重PCR荧光定量PCR（Q-PCR)反转录PCR(reversetranscription,RT-PCR)巢式PCR(NESTPCR)递减PCR(TouchdownPCR)**原理：扩增引物相反方向DNA 序列的技术。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究. **已知序列未知序列反向PCR(InversePCR,IPCR)1.用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶消化大分子量的DNA2.产生的大小不同的线性DNA片段群体，其中具靶DNA区段的DNA分子长度不超过2-3Kb,经连接后环化成环状分子3.按靶序列设计的一对向外引物同靶序列5，--端互补序列退火结合，其延伸方向如图中箭头所指4.经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子，它是由左侧的序列和右侧序列首位连接而成，其接点就是限制酶的识别位点**应用：利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。应用于染色体步移、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。局限性：需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。**就像任何DNA一样，PCR的双链DNA产物也可以供序列测定使用。然而，按照Sanger双脱氧末端链终止法测定DNA的核苷酸序列，最好是使用单链模版DNA。现在已经发展出了一种专门用于制备单链DNA的技术—不对称PCR技术。这种技术，除了使用的两种引物浓度相差100倍以外，其他的方面跟常规PCR技术没有什么本质的区别。不对称PCR**基本原理：PCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的1%（或2%）。经过PCR循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNA序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的DNA链做模板，继续引导DNA合成。这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的DNA要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态。**不对称PCR的原理多重PCR   一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplexPCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同　多重PCR的试验步骤同一般的PCR操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而不是一对引物。1.DNA提取：DNA提取可以用DNA提取试剂盒或实验室常用的一些DNA提取方法进行。2.DNA定量：用紫外分光光度计进行DNA含量测定。3.多重PCR扩增：反应体系可以选定为20μl，50μl等，反应体系中含有：DNA模板，Mg++，dNTP，TaqDNA聚合酶，各种引物等。根据实验要求，设计合适的循环参数。在设计循环参数时要注意两个原则：一是退火温度要足够高。这是因为，多重PCR技术是在扩增体系中加入了多对引物同时进行扩增，这样就会由于错配而产生一些非特异性的扩增产物，增高退火温度，可以有效的减少非特异性扩增产物的生成；二是循环参数要尽量少，以利于 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扩增产物。多重PCR在一个反应体系中同时扩增多个DNA段，其扩增效率并不是完全相同的，循环参数的增加，会使Taq酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混乱，所以，循环次数不宜过多。4.电泳检测及结果分析：取扩增产物10×与26×载样缓冲液(溴酚蓝)混匀上样，同时加入分子量标准，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlE、恒压(200-600V)、电泳1-2小时后，置凝胶于紫外检测凝胶分析仪观察结果，并拍照，记录分析结果。多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。1）多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.2）某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.应用荧光定量PCR(Q-PCR)Q-PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析将模板稀释成一系列的浓度梯度进行PCR反应，用个这个结果作标准曲线，模板可以用已知浓度的样品或未知浓度的样品。用模版初始量的log值对每个稀释样品的Ct值作图，两者称递减的线性关系，称之为标准曲线。作标准曲线用来评定反应条件的优化（保证样本有准确可重复的实验结果）Q-PCR荧光化学方法1）DNA结合燃料（SYBRGreen1）SYBRGreen1是荧光定量PCR最常用的DNA结合燃料，与dsDNA非特异性结合。在游离的状态下，SYBRGreen1发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA结合，荧光强度增加1000倍。缺乏特异性；不能用于多重反应，因为不能区分不同扩增子发出的荧光，用于单重实验。2）荧光燃料标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针（TaqMan和分子信标）TaqMan实验主要优点：高特异性、高信噪比和能进行多重反应。缺点：探针的初始成本比较高和实验设计比较繁琐。荧光 报告 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基团的种类：FAM(发绿色荧光)、HEX、TAMRA、TexasRed和Cy5等分子信标（molecularbeacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。Q-PCR的应用（1）荧光定量PCR数据分析，绝对定量和相对定量。生物学家通常对下列事情感兴趣：a)给定的血样中的病毒颗粒数；b)相当量的肿瘤组织和正常组织比，p53mRNA改变了多少倍。（2）基因表达差异分析。例如：与一个生物合成途径有关的三个基因（A、B、C），选择内参基因为β-actin，在两个样本（a、b）中的相对表达情况。用TaqMan探针进行多重实验扩增分析基因表达差异（3）基因型/等位基因分析，例如SNP检测等（4）转基因生物检测，比如可以准确的检测食品中某一种转基因成分的含量。其实就是跟野生型生物相比该基因表达量RT-PCRRT-PCR有很高的敏感性，可以用来分析不同组织，或是相同组织不同发育阶段中mRNA表达状况的相关性。**巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等　　巢式PCR，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的PCR。TouchdownPCR用来避免非特异性序列的扩增PCR中引物的黏合温度(annealingtemperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。递减PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。**鉴定基因亲子鉴定诊断遗传病克隆基因诱变分析远古DNA鉴定特定表型的突变体基因比较基因表达量PCR的应用**参考文献：1吴晓梅.人工杂交法获得拟南芥酯酶基因位点AT1G54790/AT2G429双突变体及其PCR鉴定与表型分析[J]2010.49(6):1285-12882陈阳婷.三重RT-PCR快速检测多种马铃薯病毒的研究[J]2010.6:75-77徐君怡曹际娟于珂徐杨.PCR方法特异性鉴定狮源性制品[J]2010.7:44-46袁继红.实时荧光定量PCR技术的实验研究[J]2010.13:20-22徐君怡曹际娟王秋艳王长文.SYBRGreenⅠ实时荧光PCR检测鉴定狮制品[J]2010.31(4):171-174雷群英.PCR技术的种类及其应用[J]1998.29(4):44-47**杨坤，优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究[J]2010.10：5002-50058王静，反向PCR分离侧翼序列技术研究进展[J]2010.3：200-202马沁沁，水稻花药绒毡层特异表达启动子的分离与表达载体构建[J]2010.11（4）：200-20510张于勤，多对型特异性引物巢式PCR检测乙型肝炎病毒基因型分析[J]2010.7（13）：1306-1308谢谢