沉淀法

沉淀法生物下游技术安徽医科大学微生物学教研室丁晓娟第四章提取（初步纯化）主要任务：提高溶液中的产品的浓度，同时也取出一些杂质，为后道精制工序创造有利条件。传统的方法：沉淀法、萃取法、吸附法、离子交换；另外有膜分离、凝胶电泳等。沉淀法（Precipitation）沉淀法（Precipitation）改变溶液条件，使溶解在溶液中的目的物以固体形式分离出的操作技术。分：结晶法与沉淀法。沉淀法是实验室、生产中分离制备生物大分子常用的方法。利用不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。特点：方法简单成本低使用广泛一般作为初步分...

生物下游技术安徽医科大学微生物学教研室丁晓娟第四章提取（初步纯化）主要任务：提高溶液中的产品的浓度，同时也取出一些杂质，为后道精制工序创造有利条件。传统的方法：沉淀法、萃取法、吸附法、离子交换；另外有膜分离、凝胶电泳等。沉淀法（Precipitation）沉淀法（Precipitation）改变溶液条件，使溶解在溶液中的目的物以固体形式分离出的操作技术。分：结晶法与沉淀法。沉淀法是实验室、生产中分离制备生物大分子常用的方法。利用不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。特点：方法简单成本低使用广泛一般作为初步分离的手段一般操作过程在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂沉淀物的陈化，促进晶体生长离心或过滤，收集沉淀物盐析有机溶剂沉淀等电点沉淀非离子多聚物沉淀法沉淀方法其他生成盐复合物方法亲和沉淀选择性的变性沉淀SIS聚合物与亲和沉淀蛋白质表面特性蛋白质溶解：相似者相溶亲水性和疏水性：有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。蛋白质溶液的稳定因素1)、水化层(hydrationshell)tighthydrationshell(0.35gwater/1gpro)loosehydrationshell(2gwater/1gpro)2)、静电排斥zeta电势NernstPotential—胶核表面电位(不可测)SternPotential—(不可测)Potential—滑面电位(可测,mobility)水化层zeta电势静电排斥TighthydrationshellProteincoreLoosehydrationshell（一）盐析法(Saltingout)早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。在蛋白质溶液中加入中性盐后会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。Cohn方程式现在常用Cohn 经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系：㏒S=β－ＫsＩS——蛋白质的溶解度，g/L;I－一离子强度等于I=1/2∑mizi2mi——离子i的摩尔浓度；Zi——所带电荷；β——常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有关;Ks——盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。IgS=β′-Ｋs′mCohnx经验式（用浓度代替离子强度）m=盐的摩尔浓度.有时为简单计算，也可以用浓度代替离子强度，则上式成为：常数Ks代表图中直线的斜率；β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。Β与溶液的温度和pH有关，与盐的种类无关。2.161.46血纤维蛋白原1.22卵清蛋白0.94牛肌红蛋白1.000.71牛血红蛋白磷酸盐（NH4)2SO4Ks用盐析法分离蛋白质的两种方法Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。2、影响盐析的主要因素1）蛋白质起始浓度蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；较适中的蛋白质浓度是2.5%~3.0%（25mg/ml~30mg/ml)盐溶(saltingin)：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯水中的溶解度大大增加）；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；离子种类的影响Ks2）离子强度和种类图不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）(○)NaCl;(▼)KCl;(◘)MgSO4;(▲)NH4)SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;(■)柠檬酸三钠无机盐种类阴离子盐析作用顺序柠檬酸盐>PO43－>SO42－>CH3COO－>Cl－>NO3－>SCN－阳离子盐析作用顺序（一价）NH4+>K+>Na＋(NH4)2SO43）温度温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小4）pH值除与蛋白质和温度有关外，还与pH有关；盐析pH的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH作为盐析pHpH对碳氧血红蛋白的磷酸盐盐析曲线的影响（二）等电点沉淀法概念：调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀原理：蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面静电荷为零，双水层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀实例从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。原理亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加。水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。（三）有机溶剂沉淀法特点有机溶剂沉淀法的优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。温度有机溶剂与水混溶时放出相当数量的热量，使体系温度升高，增大了有机溶剂对蛋白变性的影响。pH值许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果。影响因素较低离子强度的存在有利于沉淀作用，甚至具有保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质pH值的作用。稍高的中性盐会使蛋白质产生盐溶。离子强度有机溶剂沉淀实例（四）非离子型多聚物沉淀法聚乙二醇(PEG)、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等沉淀效能高；操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀后易除去；无毒、不可燃；广泛用于核酸、蛋白等的分离纯化。机制：可能降低生物大分子水化度，与大分子发生共沉作用；与生物大分子形成复合物；或通过空间位置排斥，使液体中的微粒被迫聚集而沉淀。常用PEG6000-20000；PEG的沉淀效果除与沉淀剂的浓度有关外，还受离子强度、pH和温度的影响

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