白芍总苷对雷公藤多苷治疗狼疮性肾炎减毒增效作用的实验研究

中药新药与临床药理2009年11月第20卷第6期 ·513· 白芍总苷对雷公藤多苷治疗狼疮性肾炎减毒增效作用的实验研究 李振彬1，王志强-·2宫彩霞3耿丽芬-，惠乃玲·，朱建君-(1．中国人民解放军白求恩国际和平医院，石家 庄050082；2．河北医科大学研究生学院，石家庄050017；3．石家庄平安医院，石家庄050051) 摘要：目的探讨白芍总苷(TGP)对雷公藤多苷(TG)治疗狼疮性肾炎(1upusnephritis，LN)小鼠的减毒增效作 用。方法 取B6D2F1代杂交小鼠建立慢性移植物抗宿主病(cGVHD)LN小鼠模型。将成模小鼠随机分为3 组，模型(LN)组、TG组、TG+TGP组，每组6只，另设正常对照组6只。TG组给予雷公藤多苷灌胃，剂 量为30mg·kg。1·d。1；TG+TGP组给予雷公藤多苷及白芍总苷灌胃，剂量分别为30mg·kg。1·d一和200mg· kg。1·d～，正常对照组和LN组分别给予等容量生理盐水灌胃，每日给药1次，各组给药方法及时间均相同， 共计4周。实验结束时，观察并比较各组小鼠的24h尿蛋白排泄率(UPE)、肝肾功能及肾脏病理改变。结果 与LN组相比，TG组、TG+TGP组小鼠的24hUPE、尿素(BUN)、肌酐(SCr)显著降低(P<0．05或P< 0．01)，TG+TGP组显著低于TG组(P<0．05或P<0．01)。与LN组相比，TG组小鼠的ALT、AST和MDA均 显著增高(P<0．01)，SOD、GSH均显著降低(P<0．05或P<0．01)。与TG组相比，TG+TGP组的ALT、 AST、MDA均显著降低(P<0．01)，SOD、GSH均显著增高(P<0．01)。TG+TGP组对LN肾脏病理改变的改 善作用显著优于TG组(P<0．05或P<0．01)。结论TGP对TG治疗LN具有减毒增效的作用。 关键词：白芍总苷；雷公藤多苷；狼疮性肾炎；减毒增效；小鼠 中图分类号：R285．5文献标识码：A 文章编号：1003—9783(2009)06—0513—04 Toxicity——reducingandAction—-enhancingEffectsofTotalGlucosidesofPaeonyonTripterygiumGlycosidesin TreatingLupusNephritis LIZhenbin’，WANGZhiqian91’2GONGCaixia3，GENGLifenl，HUINailin91，ZHUJianjunl(1．BethuneInternation· alPeaceHospitalofPLA，Shijiazhuang050082，China；2．GraduateAcademyofHebeiMedicalUniversity，Shiji— azhuang050017，China；3。ShijiazhuangPing’anHospital，Shijiazhuang050051，China) Abstract：0bjectiveToinvestigatethetoxicity—-reducingandaction—-enhancingeffectsoftotalglucosidesofpaeony (TGP)ontripterygiumglycosides(TG)intreatingmurinelupusnephritis(LN)．MethodsChronicgraft—versus—host disease(cGVHD)murineLNmodelwasestablished．Modelingmicewererandomlydividedintothreegroups：LN group，TGgroup(inthedoseof30mg。kg‘1。d一)，andTG+TGPgroup(TGinthedoseof30mg。kg一·d—and TGPinthedoseof200mg。kg一。d‘1)，6miceineachgroup．Anothersixnormalmiceservedascontr01．Medication groupsreceivedcorrespondingmedicineaccordingtotheexperimentaldesign，andmiceinthenormalcontrolgroupand LNgroupreceivedthesamevolumeofsaline，qd，for4weeks．Afterthetreatment，thelevelsof24一hoururinarypro— teinexcretion(UPE)，bloodureanitrogen(BUN)，serumcreatinine(SCr)，serumalaninetransferase(ALT)andas． partatetransferase(AST)，andcontentsofsuperoxidedismustase(SOD)，malondialdehyde(MDA)，andglutathione peroxidase(GSH—Px)inlivertissuehomogenateweremeasured．Meanwhile。thepathologicchangesofkidneysineach groupweredetected．ResultsComparedwithLNgroup，levelsofUPE，BUNandSCrinTGgroupandTG+TGPgroup weredecreasednotablely(P<0．05orP<0．01)，andlevelsofaboveindexesinTG+TGPgroupwaslowerthanthose inTGgroup(P<0．05orP<0．01)．ThelevelsofALT，ASTandMDAinTGgroupwereincreasedsignificantly。and thelevelsofSODandGSHweredecreasedmarkedlycomparedtoLNgroup(P<0．05orP<0．O1)．ComparedwithTG group．thelevelsofALT，ASTandMDAinTG+TGPgroupweredecreasedsignificantlyandthelevelsofSODandGSH 收稿日期：2009—07—24 作者简介：李振彬(1962一)，男，医学博士．主任医师，研究方向：风湿免疫性疾病的中西医结合治疗。Email：lizhenbinl962@sobu．com。 基金项目：河北省中医药管理局资助课题(2008081)。 万方数据 』．!璺： ．． !堕鱼i!i垒!堂gbi里!!￡旦!坠g曼!!!!堕!鱼￡!i卫i!尘旦垒堕!i!!!!gY：2鲤里盟!!!!!照!：yQ!：2Q盟!：鱼 wereincreasedremarkably(P<0．01)．TheeffectonimprovingthepathologicchangesofkidneysinTG+TGPgroupwas betterthanthatinTGgroup(P<0．05orP<0．01)．ConclusionTGPhastoxicity—reducingandaction—enhancing effectsonTGintreatingLN． Keywords：Totalglucosidesofpaeony；Tripterygiumglycosides；Lupusnephritis；Toxicity—reducingandaction— enhancingeffects；Mice 雷公藤多苷(tripterygiumglycosides，TG)广泛应 用于风湿病、肾病等免疫相关性疾病的治疗，但其 毒副作用明硅。如何增强TG的疗效并防治其毒性反 应是目前研究的重点之一。本课题组采用慢性移植 物抗宿主病(chronicgraft—versus—hostdisease， cGVHD)狼疮性肾炎(LN)小鼠模型，观察白芍总苷 (totalglucosidesofpaeony，TGP)对TG治疗LN的减 毒增效作用，为临床中药有效成分配伍治疗LN提供 实验依据。 1材料与方法 1．1动物DBA／2小鼠100只，雌性，SPF／VAF 级，6—8周龄，体重(13±3)g；(C57BL／6J×DBA／2) F1(即B6D2FI)杂交鼠55只，雌性，SPF／VAF级， 8—10周龄，体鼋(164-3)g，均购于北京维通利华实 验动物技术有限公司，实验动物质量合格证号： 0110094，实验动物使用许可证号：SCXK(京) 2007—0001，饲养于白求恩国际和平医院医学实验 动物中心。 1．2药物雷公藤多苷片，浙江得恩德制药有限公 司，批号：0707106，规格：10mg／片；白芍总苷， 由朗生医药(深圳)有限公司惠赠。 1．3试剂小鼠淋巴细胞分离液，由天津市灏洋生物 制晶科技有限责任公司提供，批号：20071226；抗核 抗体(ANA) 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 试剂盒，由欧蒙(德国)医学实验诊断 股份公司提供，批号：F080408YA；异硫氰酸荧光素 标记的亲和纯化兔抗小鼠IgG，北京博奥森生物技术 有限公司提供，批号：070815；尿蛋白定量试剂盒 (批号：20080128)、肝组织匀浆超氧化物歧化酶 (SOD)(批号：20080626)、丙二醛(MDA)(批号： 20080626)、还原型谷胱甘肽(GSH)(批号： 20080626)测定试剂盒，均购于南京建成生物工程研 究所。 1．4仪器 CS501型超级恒温水浴(上海浦东科学仪 器有限公司)，JYl20药物电子天平(上海民桥精密科 学仪器有限公司)，TGL一16G型低温台式离心机(上 海安亭科学仪器厂)，722分光光度计(上海第三分析 仪器厂)，Histachi7170全自动生化分析仪(13本His． tachi公司)，JUNGBIOCUT2035型石蜡切片机(德国 Leica公司)，QP—B型切片漂烘温控仪(安徽电子科 学研究所)，YWY781B型医用微波炉(浙江临安电子 器材厂)，CX—PC一2型倒置显微镜(日本OLYMPUS 公司)，HPIAS一1000型全自动彩色病理图像分析系 统(武汉千屏影像技术有限责任公司)。 1．5分组，造模’；给药参考文献¨1方法，略作改 进，建立cGVHD小鼠模型。取B6D2F1代杂交小鼠 55只，随机分成2组，正常对照组6只、模型组49 只。无菌分离DBA／2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结，在 生理盐水中研磨，将研磨后细胞悬液经150斗m和70 Ixm尼龙筛过滤至培养皿中，再按其体积比为1：1的 比例顺管壁小一c,jJD入含有淋巴细胞分离液的离心管 中，2000r／min离心20min，吸出淋巴细胞层，用 PBS稀释洗涤3次，第1次1800r／min离心10 min，以后均为1800r／min离心5rain，最后在显微 镜下观察计算细胞数量，用PBS制备成适量、混匀 的淋巴细胞悬液，其中，脾脏、胸腺、淋巴结细胞比 例为3：2：1，淋巴细胞悬液终浓度2×10s／mL。台 盼蓝拒染实验测定细胞存活率高于90％。模型组每 只鼠每次取含50×106个淋巴细胞的淋巴细胞悬液， 约0．25mL，于第1、4、7、10天经尾静脉注射到 B6D2F1代杂交小鼠体内。正常对照组给予等体积生 理盐水。造模第8周末(即第56天)断尾采血测抗核 抗体、代谢笼留尿测24h尿蛋白定量。抗核抗体阳 性、24h尿蛋白定量>3．0mg者入组。取成模小鼠 18只，随机分成模型(LN)组、TG组、TG+TGP 组，每组6只。在造模后第9周(即第57天)，正 常对照组、LN组分别给予生理盐水灌胃；TG组给予 雷公藤多苷灌胃，剂量为30mg·kg。1·d。1；TG+ TGP组给予雷公藤多苷及白芍总苷灌胃，剂量分别为 30mg·kg。1·d一和200mg·kg一·d～，每日给药1 次，各组给药方法及时间均相同，共计4周。 1．6指标检测 1．6．1尿蛋白测定实验结束前l天，将小鼠置于代谢 笼内，留取24h尿液，测24h尿蛋白排泄率(UPE)， 万方数据 中药新药与临床药理2009年11月第20卷第6期 ·515· 严格按照试剂盒说明书检测(考马斯亮蓝法)。 1．6．2血清尿素(BUN)、肌酐(SCr)、丙氨酸氨基转 移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)的测定实 验结束时，麻醉小鼠，心尖取血，离心后，Hitachi 7170全自动生化仪检测各组小鼠血清BUN、SCr、 ALT和AST的含量。 1．6．3肝脏组织匀浆丙二醛(I、，IDA)、超氧化物歧化 酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的测定无菌摘取 肝脏，制备10％的肝脏组织匀浆，Hitachi7170全自 动生化仪检测蛋白含量，按照试剂盒说明书检测肝脏 组织匀浆MDA、SOD和GSH的含量。 1．6．4肾脏组织学检查无菌条件下摘取双肾，置于 10％中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，分别 进行HE、PAS和Masson染色，病理组织学观察，按 照文献121半定量计分法测量肾小球硬化指数，每只动 物计算25个肾小球取平均值。肾小管间质损害的特征 按0—3分半定量计分：无变化评0分；轻度改变评 1分；中度评2分；严重评3分。小管间质损害的总积 分为5个组织学特征(小管萎缩、间质纤维化、水肿、 炎症、小管再生／退行性病变)单项计分的总和¨l。 1．7统计学处理所有实验数据均采用SPSS13．0软 件包进行统计学处理，所得结果均以“均数± 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差” 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示。各组间均数比较采用单因素方差分析 (one—wayANOVA)。方差分析前，进行方差齐性检 验，采用LSD法进行组间两两比较。 2结果 2．1对各组小鼠UPE、BUN和SCr水平的影响与 正常对照组相比，LN组小鼠的24hUPE、BUN和 SCr均显著增高(P<0．01)。与LN组相比，TG组和 TG+TGP组均可有效降低LN小鼠的24hUPE、BUN 和SCr水平，具有非常显著性差异(P<0．01)。同 时，TG+TGP组的24hUPE、BUN和SCr显著低于 TG组，差异具有显著性(P<0．05或P<0．01)，见 表1。 表1 对各组小鼠24hUPE、BUN 和scr水平的影响(孑±s，，l=6) 组别 剂量 24h UPE／mg BUN／Ⅻol‘L“scr／“moI．L‘ 正常对照组 一 1．40±O．50+’6．74±1．oo’’45．43±8．51‘‘ LN组 一 7．∞±O．84 10．81±I．36130．4818．82 TG组 30喵·kg‘‘ 3．“±0．57“ 8．47±1．20“75．92±8．66“ 代+他P组30mg·kg“+200mg’kg～2．22±O．56”666．66±1．06”658．57±5．45”66 注：与LN组比较，”P<0．Ol；与TG组比较，6P<0．05， △6P<0．01。 2．2对各组小鼠ALT和AST含量的影响与LN组 相比，TG组小鼠的ALT和AST含量均显著增高，具 有非常显著性差异(P<0．01)。与TG组相比，TG+ TGP组的ALT和AST含量显著降低，具有非常显著 性差异(P<0．01)，见表2。 表2对各组小鼠ALT和AST含量的影响(互±s。rI=6) 注：与LN组比较，”P<0．01；与TG组比较。66P<0．01。 2．3对各组小鼠肝脏组织匀浆SOD、MDA和GSlt 水平的影响与LN组相比，TG组小鼠的SOD、GSH 显著降低(P<0．01)，NDA显著增高(P<0．01)。与 TG组相比，TG+TGP组的SOD、GSH显著增高(P< 0．01)，MDA显著降低(P<0．01)，见表3。 表3 对各组小鼠肝脏组织匀浆SOD、 MDA和GSH水平的影响(i±s，，l=6) 组别 剂量 soD／u·mg。MDA／Ⅲl·mg“GSH／IⅧ01·mg。 正常对照组 一 158．40±20．466．59±2．1234．53±9．71 LN组 一 155．89±22．436．95t2．∞27．65±5．87 TG组 30mI；·k一 90．37±17．91”18．90±2．26*’19．27±6．89’‘66 TG+代P组30mg’kg。1+200mg’kg～161．55±15．15“6．90±1．81“34．07±1113“ 注：与LN组比较，“P<0．Ol；与TG组比较，“P<0．01。 2．4对各组小鼠肾脏病理变化的影响正常对照组小 鼠肾小球呈球形，未见肿胀或萎缩，肾小球细胞数量 未见增多，系膜基质无增生，肾小球囊腔无扩大或缩 小。近端小管和远端小管管腔无肿胀。LN组小鼠部 分肾小球呈弥漫性肿胀增大，系膜细胞和基质增生， 内皮下可见嗜复红物质沉积，部分肾小球有白金耳样 改变，球囊粘连，肾小管水肿、坏死，出现蛋白管 型，肾间质大量炎细胞浸润，较正常对照组病变明显 加重。TG组、TG+TGP组小鼠肾脏病变均较LN组 有所减轻。各组肾小球细胞数、肾小球硬化指数和小 管间质损伤评分比较见表4。 表4对各组小鼠肾脏病理变化的影响(；±s。n=6) 组别 剂量 肾小球细胞数 肾小球硬化指数小管问质损伤评分 正常对照纽 一 36．00±4．73‘’矿’ 0．‘ LN组 一 51．50±7．181．34±0．55 6．33±1．86 TG组 30mg·kg～41．50±7．77’0．52±0．22’’0．33±O．52*‘ TG+TGP组30mg’kg“+200mg·kg～37．20±6．46“0．34±0．25““0．19±0．55“6 注：与LN组比较，’P<0．05，“P(0．叭；与TG组比较，6尸 <0．05。△6P<0．Ol。 万方数据 ：墨!鱼： !望鱼i!iQ卫!!￡丛!!!!旦婴g塑璺!!!匹b鱼￡丛!i!堂堕!!坐§!!l!gY：2QQ里盟!!!翌鲢12y!!：2Q盟!：鱼 3讨论 TG是雷公藤根部的提取物，是雷公藤的主要有 效成分。现代药理研究证明其具有较强的抗炎和免疫 抑制作用。大量实验和临床证据已经证实，包括TG 在内的多种雷公藤制剂对系统性红斑狼疮(SLE)和 LN有较好的临床疗效【3“】。TG免疫抑制作用明显， 但其对肝脏的损害也较严重，影响了其使用时限。研 究表明17I中药雷公藤造成肝损伤，轻者可出现肝脏肿 大，肝细胞浊肿或脂肪变，重者出现肝脏出血、肝细 胞坏死。另有研究181证实，TG的副作用与其治疗量 呈正相关，剂量大时副作用明显增加，剂量小则副作 用发生率明显降低，如同时加用保肝药物，则肝脏副 作用的发生率会有所下降。由于免疫相关性疾病常常 需要长期应用TG治疗，因此，如何防治其肝脏毒副 作用成为临床亟待解决的问题。 本课题研究显示，TG组较LN组血清ALT、AST 水平升高(P<0．01)，证实TG对肝脏毒性的存在。 TG组较LN组肝脏匀浆SOD、GSH降低，而MDA增 高。SOD是体内自由基的重要清除剂，可防止生物 膜过氧化引起的损伤作用，SOD的活性降低则自由 基清除不足。GSH对肝细胞膜过氧化的影响主要是 防止过氧化物形成，是重要的抗氧化和解毒物质， 其含量下降所致的严重肝细胞损害与脂质过氧化有 关。肝脏损伤越严重，则GSH含量越低。MDA是脂 质过氧化主要终产物，可严重损伤肝细胞膜结构， 导致肝细胞的肿胀、坏死，反映体内自由基水平。 肝损伤程度越重，MDA的含量则越高。因此，本研 究提示TG肝脏损伤的机制与增加肝脏组织内氧自由 基产生有关。 TGP是从白芍干燥根中提取的有效成分，研究证 实|91TGP具有抗炎、镇痛以及免疫调节的作用，同时 不良反应少，患者耐受性良好。另有研究¨¨121证实 TGP对不同的肝脏损伤改善明显。因此，TGP与TG 联合用药不失为一种较合理的选择。本研究表明， TG+TGP组小鼠血清ALT、AST水平低于TG组，与 TG组比较，具有显著性差异(P<0．01)，说明TGP 对TG所致肝损伤存在保护作用。TG+TGP组小鼠肝 脏匀浆中SOD、GSH高于TG组，与TG组比较，具 有非常显著性差异(P<0．01)，说明TGP可以加速 诱导氧自由基的清除。TG+TGP组小鼠肝脏匀浆中 MDA低于TG组，与TG组比较，具有非常显著性差 异(P<0．01)，说明肝组织内部氧自由基产生减 少。同时，本研究还显示，TG+TGP组较TG组的 UPE、BUN、SCr更低，能更显著的改善LN小鼠肾 脏病理变化，组间比较具有显著性差异(P<0．05或 P<0．01)，提示二者的联合使用提高了治疗LN的 疗效。 本研究为LN安全、有效、合理的联合用药，提 供了一条新的思路。 参考文献： 【l】阳晓，叶任高，陈伟英，等．慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小 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