生物化学与分子生物学实验特点：独立性，广泛应用性。范畴：几种常用生物大分子制备技术光谱技术、层析技术、电泳技术、离心技术放射性同位素技术分子克隆、外源基因
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书写实验目的：原理：操作：结果：分析/讨论：注意事项：实验七酶促反应动力学实验Enzyme;RibozymeKineticsofenzyme-catalyzedreaction酶促反应动力学概念：酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素。反应速度：单位时间内底物减少或产物增加的速度，常用初速度来衡量。产物0时间初速度酶促反应速度逐渐降低酶促反应的时间进展曲线影响酶促反应速度的因素：底物浓度[S]酶浓度[E]反应温度pH值抑制剂激活剂中间产物学说E+SESE+Pk1k2k3一、底物浓度对酶促反应速度的影响vVm0.30.2Vm20.1012345678[S][S]与v关系：当[S]很低时，[S]与v成比例--一级反应当[S]较高时，[S]与v不成比例当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应米---曼氏方程（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]米-曼氏方程解释：当[S]Km时，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]当[S]Km时，vVmax,即[S]而v不变[S]vKmVm2v=（Vm/Km）[S]v=Vm=K3[E]底物浓度对酶促反应速度的影响V=Vmax[S]Km+[S]矩形双曲线：Km与Vmax的意义Km值等于最大反应速度一半时的底物浓度；Km可用来表示酶对底物的亲和力大小，Km与酶对底物亲和力大小成反比；Km值是酶的特征性常数之一，Km值范围在10-6~10-2mol/LVmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比；k3为酶的转换数：当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变为产物的分子数。1~104/sKm值与Vmax值测定双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）1=Km1+1VVmax[S]Vmax1/V-1/Km01/[S]斜率=Km/Vmax1/Vmax二、酶浓度对酶促反应速度的影响酶的最适pH:酶催化活性最高时的pH。2810pH酶的活性pH对某些酶活性的影响A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶三、pH对酶促反应速度的影响AB一些酶的最适pH值酶最适pH胃蛋白酶1.8过氧化氢酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8四、温度对酶促反应速度的影响五、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制作用:直接或间接地影响酶的活性中心,使酶活性降低或丧失。抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。不可逆抑制（irreversibleinhibition）抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合,使酶丧失活性,不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性.SHSE+Hg2+EHg+2H+SHSSHClSE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HClSHClS巯基酶路易士气例1：巯基酶的抑制可逆抑制(reversibleinhibition)抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失,结合是可逆的,能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。可逆抑制类型：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制（non-competitiveinhibition）反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）(一)竞争性抑制(competitiveinhibition)概念竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。SSEEIIEE+P无I有I竞争性抑制的底物浓度曲线v竞争性抑制作用过程[S]竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax竞争性抑制的特征曲线：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km竞争性抑制的特点：I与S分子结构相似；Vmax不变，表观Km增大；抑制程度取决于I与E的亲和力，以及[I]和[S]的相对浓度比例。（二）非竞争性抑制（non-competitiveinhibition）概念抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑制酶活性，I和S与酶结合不存在竞争关系。非竞争性抑制作用过程：SSEEEE+PSESIIII非竞争性抑制的动力学方程:1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax（1+）[I]Ki非竞争性抑制的特征曲线：1v正常[I]1[S]-1Km1Vmax(1+)[I]Ki非竞争性抑制的特点：1、I与S分子结构不同；2、Vmax减小，表观Km不变；3、抑制程度取决于[I]大小。思考题：1、概念：酶、酶活性、反应初速度、酶活性中心、必需基团、Km、最适温度、最适pH、竞争性抑制、2、比较竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制作用特点及林-贝氏图；简述竞争性抑制的理论和实际意义。可逆性抑制作用的动力学比较作用特点无抑制剂竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制与I结合组分动力学参数表观Km表观Vm双倒数作图斜率纵轴截距横轴截距KmVmKm/Vm1/Vm-1/KmEKm(1+[I]/Ki)VmKm(1+[I]/Ki)/Vm1/Vm1/Km(1+[I]/Ki)E、ESKmVm/(1+[I]/Ki)Km(1+[I]/Ki)/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-1/KmESKm/(1+[I]/Ki)Vm/(1+[I]/Ki)Km/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-(1+[I]/Ki)/Km酶的分类1、氧化还原酶（oxidoreductase）2、转移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、异构酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）1.加入酶液立即计时，迅速混匀置37℃水浴15min。注意：酶促反应开始，从加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应，各管反应时间应准确一致，均为15分钟。2.保温后各管立即加入0.5MNaOH溶液1.0ml，快速混匀，防止局部浓度过高。3.各管混匀之后再分别加入0.3%4-AA1.0ml及0.5%K3Fe（CN）62.0ml，混旋仪充分振荡混匀，使显色完全。室温放置10min后以6号管校正零点，在分光光度计中比色(λ=510nm)注意：必须立即混匀，否则显色不完全。注：表1～表3中，基质液即底物液（磷酸苯二钠）表1表2以下操作同表1步聚中1、2、3、步表3以下操作同表1步聚中1、2、3、步拓展1、可通过以后要学习的实验，开展酶的分离，纯化，理化特性分析研究。2、纯化酶可进行结构、序列分析。3、可通过修饰等方法掌握酶的活性中心。4、可进行酶的细胞化学定位。5、可进行同功酶分析，了解不同物种、品种、品系的遗传性差异。
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