蚕豆多倍体诱导和鉴定实验设计
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一、实验目的初步认识化学诱发植物多倍体的过程，学习利用孚尔根反应（染色）鉴定多倍性细胞的方法。二、实验材料：蚕豆根尖三、实验药品及工具：生物显微镜、剪刀、镊子、解剖针、载玻片、小玻璃瓶、小酒杯、培养皿、恒温箱、0.1%-0.2%秋水仙碱溶液、希夫氏试剂（是一种将碱性复红在酸性溶液中以过剩的亚硫酸（亚硫酸氢钠等）脱色的试剂）、纯净水、1mol1-1盐酸等四、实验原理：多倍体的发生，尤其是异源多倍体的产生是生物进化的重要途径之一。正常细胞的有丝分裂，在中期已复制为两的染色体，都集中于中央赤道板上，染色单体由于纺锤丝的牵引至后期分别趋向细胞两级。纺锤丝主要化学组成为蛋白质。一般认为蛋白质分子中的二硫键可以被细胞中辅酶的-SH（巯基）还原，于是由分子内的二硫键转变为分子间的二硫键，从而使蛋白质分子聚合。凡是能抑制巯基作用又能保持细胞活性的物质，就能阻止蛋白质分子聚合或使已构成纺锤丝的蛋白质分子间发生解聚作用，致使纺锤丝不能形成或断裂，从而消失，造成染色单体不能分向细胞两极，细胞质也不分离，复制的染色体仍存在于一个细胞中，结果染色体倍增。如果该细胞在下一次细胞分裂时又经药剂作用，则可产生更高倍数的细胞，（一般成等比级数增加，但也会出现奇数倍或非整倍现象，且由于药物的毒性作用染色体不会无限止的增多），这样就形成了多倍性细胞。在药剂作用的过程中，由于同一组织中的不同细胞有丝分裂的不同步性，而出现加倍程度不一的表现，这种现象称为混倍性（混倍现象）。经加倍了的细胞，一旦停止药剂作用，仍能进行正常的有丝分裂。由此而产生的子细胞，一般说都是多倍性细胞，从这种细胞分化出来的植株，就是多倍体。人工诱发多倍体的方法很多，分为物理的（变温、机械损伤、射线处理等）和化学的，我们常采用秋水仙素来进行诱导，这是诱发多倍体最有效的方法，此外还有六氯代苯、a-溴代萘、对-二氯代苯、申苯磺硫苯胺基苯汞（富民隆的主要成分）等化学物质均有此作用。鉴定多倍体，可采用间接和直接的方法。间接方法包括形态学和细胞学的观察，直接法是直接对试材检测染色体的数目。一般来讲，多倍体植物在形态学和细胞学上的特征表现为:气孔、花器、花粉粒、种子、果实甚至叶片等明显变大，单位面积叶片上的气孔数目减少而密度降低等。考虑到染色体观察、记数较为烦琐，首先对试材从形态学和细胞学上来初步判断是否为多倍体，然后把初步断定为多倍体的试材再观察、记录染色体数目是否真正地发生了倍性的变异，从而最终确定为多倍体。五、实验步骤：1、将根长为0.5厘米左右的发芽蚕豆，投入0.2%的秋水仙碱溶液内，处理3-6小时，取出继续培养24小时。以上过程均需在恒温（25C___28C）下进行。2、当肉眼可以看到根尖明显膨大时，即可取出冲洗，将膨大的根尖离体放入0.1%的秋水仙碱溶液中2-3小时，也可用8-羟基喹啉等具有染色体扩散能力的药液处理，纯净水冲洗后用固定液固定。3、用不同浓度的乙醇洗涤（同有丝分裂），把根尖放入1mol.l-lHCl中60C水解12分钟，注意温度和时间一定要准确，否则影响染色效果。4、将水解好的根尖放入盛有希夫氏试剂的小黑瓶中染色0.5-3小时，将根尖取出用漂洗液漂洗3次，每次3分钟。蒸馏水洗2分钟，45%冰醋酸压片（方法同有丝分裂），镜检计数染色体。必要时进行数码显微摄影保存染色体图像。附录：孚尔根染色法原理：细胞中的DNA受1NHC160C水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。
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