GB4789.3-2010 食品微生物学检验 大肠菌群计数

中华人民共和国国家 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 GB 4789.3—2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms 中华人民共和国卫生部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 GB 4789.3—2010 I 前 言 本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。 本标准与GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下： ——修改了标准的中英文名称； ——“第二法 大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU～150 CFU”； ——删除了“第三法 大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。 本标准的附录A、附录B为 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。 GB 4789.3—2010 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 1 范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 2 术语和定义 2.1 大肠菌群 coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 最可能数 most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 3.3 恒温水浴箱：46 ±1 ℃ ℃。 3.4 天平：感量 0.1 g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 3.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 3.11 菌落计数器。 4 培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。 GB 4789.3—2010 2 4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录 A 中 A.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录 A 中 A.3。 4.4 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.4。 4.5 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.5。 4.6 无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A 中 A.6。 4.7 无菌 1 mol/L HCl：见附录 A 中 A.7。 GB 4789.3—2010 3 第一法 大肠菌群 MPN 计数法 5 检验程序 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。 6.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。 36℃±1℃ 48h±2h 36℃±1℃ 48 h±2 h 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释 选择适宜 3 个连续稀释度的样品匀液，接种 LST 肉汤管 产 气 不产气 BGLB 肉汤 不产气 产 气 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 查 MPN 表 报告结果 GB 4789.3—2010 4 6.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。 6.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续 培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 6.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的 MPN值。 第二法 大肠菌群平板计数法 7 检验程序 大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。 图2 大肠菌群平板计数法检验程序 8 操作步骤 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释 36℃±1℃ 18h~24h 计数典型和可疑菌落 BGLB 肉汤 36℃±1℃ 24h~48h 报告结果 选择 2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液，接种 VRBA 平板 GB 4789.3—2010 5 8.1 样品的稀释 按6.1进行。 8.2 平板计数 8.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐 水加入无菌平皿作空白对照。 8.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心 旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平 板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 8.3 平板菌落数的选择 选取菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。 8.4 证实试验 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃ 培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 8.5 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g （mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取 其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105 CFU/g（mL）。 GB 4789.3—2010 6 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.8±0.2 A.1.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 10 mL。121 ℃高压 灭菌 15 min。 A.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL 0.1%煌绿水溶液 13.3 mL 蒸馏水 800 mL pH 7.2±0.1 A.2.2 制法 将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL 蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL， 用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭 菌15 min。 A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） A.3.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 胆盐或3号胆盐 1.5 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15 g～18 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4±0.1 GB 4789.3—2010 7 A.3.2 制法 将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45 ℃～ 50 ℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。 A.4 磷酸盐缓冲液 A.4.1 成分 磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.4.2 制法 贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。 A.5 无菌生理盐水 A.5.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.5.2 制法 称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。 A.6 1 mol/L NaOH A.6.1 成分 NaOH 40.0 g 蒸馏水 1000 mL A.6.2 制法 称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。 A.7 1 mol/L HCl A.7.1 成分 HCl 90 mL 蒸馏水 1 000 mL A.7.2 制法 移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。 GB 4789.3—2010 8 附录B （规范性附录） 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。 表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 95%可信限 阳性管数 95%可信限 0.10 0.01 0.001 MPN 下限 上限 0.10 0.01 0.001 MPN 下限 上限 0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 -- 注 1：本表采用 3 个稀释度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)]，每个稀释度接种 3 管。 注 2：表内所列检样量如改用 l g （mL）、0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低 10 倍；如改用 0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高 10 倍，其余类推。