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DNA 的提取方法

DNA 的提取方法一种快速微量外周血基因组DNA 的提取方法　配制　6 mol/ LNaI 中含10 mmol/ L 2 - 巯基乙醇,置棕色瓶中室温保存至少1 年。 1. 3 　方法取EDTA - NaI 抗凝血100μl 加入1. 5 ml 离心管中,加入1000μl 无菌去离子水,轻轻颠倒5～10 次,5 000 r/ min 离心3 min ,弃去上清液1000μl ,加入 6 mol/ L Nal100μl ,混旋10 s ,加入200μl 氯仿∶异戊醇(24∶1) ,混旋30 s ,10 000 r/ min...

一种快速微量外周血基因组DNA 的提取方法　配制　6 mol/ LNaI 中含10 mmol/ L 2 - 巯基乙醇,置棕色瓶中室温保存至少1 年。 1. 3 　方法取EDTA - NaI 抗凝血100μl 加入1. 5 ml 离心管中,加入1000μl 无菌去离子水,轻轻颠倒5～10 次,5 000 r/ min 离心3 min ,弃去上清液1000μl ,加入 6 mol/ L Nal100μl ,混旋10 s ,加入200μl 氯仿∶异戊醇(24∶1) ,混旋30 s ,10 000 r/ min 离心3 min ,取上清液150μl 于另一离心管中,加入90μl 异丙醇,混匀后,10 000 r/ min 5 min ,弃去上清液, 加入1 000μl 75 %无水乙醇洗涤沉淀2 次,再加入1 000μl无水乙醇洗涤沉淀2 次,沉淀置56 ℃烘干20 min ,加入50 μl 无菌去离子水或50μl TE 溶液即可用于基因扩增和限制性内切酶酶切分析等分子生物学试验。曹外周血DNA 提取方法的比较及改良 1. 2 　方法 1. 2. 1 　DNA 的提取 1. 2. 1. 1 　常规酚/ 氯仿提取法　取枸橼酸钠抗凝血80μl ,操作方法见参考文献[1 ] 。 1. 2. 1. 2 　碘化钾提取法　取100μl EDTA2Na2抗凝血,提取法见参考文献[2 ] 。 1. 2. 1. 3 　TKM2血液DNA 提取法　取2 ml 含抗凝剂的全血加入2 ml 已配制好的溶液Ⅰ缓冲液(10 mmol Tris2HCl pH 7. 4 ,10 mmol KCl 10 mmol Mg2 Cl2 2 mmol EDTA) 和50μl NP240 ,旋涡振荡器上充分混匀,3 000 r/ min 室温离心10 min ,弃上清,细胞沉淀中再加溶液Ⅰ缓冲液,混匀后再离心,如此反复3 - 5 次,直至上清由红色变为无色。在含白细胞沉淀的试管中加入0. 32 ml 溶液Ⅱ(溶液Ⅰ中加 0. 4 mol NaCl) ,将白细胞再悬浮,然后加入50 μl 10 % SDS 和0. 30 ml 饱和NaCl 混匀,室温下轻摇过夜后,室温12 000 r/ min 离心10 min ,取上清加等量异丙醇或3 倍体积的乙醇,摇匀,置- 20 ℃1 h 以上沉淀DNA ,13 000 r/ min 离心25 min ,弃上清, 四种微量全血DNA 提取方法的比较 1.4 TT (TritonX-100 和Tris-HCl等混合液的总称)溶血法提取基因组DNA-/0 1.4.1 试剂裂解液#10.95 g蔗糖"5 ml 0.1 mmol/L M gCl2"2 ml 0.5 mmol/L Tris(HCl (pH7.5)"1 ml TritonX- 100"加水至100 ml’提取液#10 ml 0.5 mmol/L KCl"2.5ml 0.1 mmol/L M gCl2"2ml 0.5 mmol/L Tris( HCL (pH8.3)"0.45 ml NP-40"0.45 ml Tween-20"加水至100 ml’蛋白酶K 20 mg/ml (贮存液)’Tris平衡酚’氯仿’TE 缓冲液(pH8.0)! 1.4.2 基因组D N A 的提取抗凝全血0.5 ml加等量的裂解液"颠倒混匀后"41放置30 min’离心 3 000 rpm "10 min"弃上清’用0.2 ml提取液"102l 蛋白酶K 储存液悬浮沉淀" 颠倒混匀后"553水浴 60 min’加等体积Tris平衡酚/氯仿(141) 颠倒混匀后"离心12 000 rpm"10 min’小心吸取上清"加入 2.5 倍体积的冷无水乙醇" 颠倒混匀后"-205静置 30 min’离心12 000 rpm"10 min"弃去水相’沉淀用 75% 冷乙醇洗涤两次"同上离心10 min"弃去上清’ 在超净工作台中空气干燥10 min" 溶于206l TE 经典酚抽提法全血基因组DNA 的提取和纯化方法比较　将新鲜抗凝全血或冷冻保存全血1 ml 置于1. 5 ml Beckman 离心管中,加细胞裂解液(0. 32 mol/ L 蔗糖,1 %Triton X - 100 ,10 mm/ L MgCl2 ,10 mmol/ L Tris - HCl pH 7. 5) ,缓慢颠倒试管混合,直到红细胞彻底裂解。室温放置10 min ,其间混合2～3 次,12 000g 离心5 min ,去上清,沉淀用无菌双蒸水洗涤1 次,倾去上清,用80μl 裂解缓冲液 (01375 mol/ L NaCl ,0. 12 mol/ L EDTA) 将沉淀轻轻混匀,再加15μl 20 % SDS ,100μl 5 mol/ L NaCl ,上下颠倒管子混匀,加240μl 无菌双蒸水,并立即加入350 μl 苯酚- 氯仿抽提缓冲液充分混合,1 200 g 离心30 min ,小心将上清液转移到另一个新的离心管中,加入等体积预冷的无水乙醇,缓慢颠倒试管进行混合, 直到出现DNA 的白色丝状沉淀,挑出DNA 至另一新的离心管中,加入500μl 70 % 乙醇(室温) 洗涤沉淀和管壁,12 000 g 离心2 min ,尽可能弃去全部上清, 将离心管倒置在干净滤纸上以干燥DNA ,加入100μl TE 缓冲液(pH7. 4) ,放入65 ℃水浴中加热1h 或在室温放置过夜以溶解DNA。 1. 5 　胍盐酸法提取基因组DNA四种全血基因组DNA 提取方法的比较 1. 5. 1 　试剂　　7. 5 molPL 胍盐酸液:72 g 胍盐酸, 10 mL 1 molPL Tris2HCl ,加水至100 mL ;蛋白酶K溶液(10 gPL) ;10 %(WPV) 十二烷基硫酸钠(SDS) 。 1. 5. 2 　DNA 的提取　　用改进的Miller 盐析法提取白细胞的方法得到白细胞,加入400μL 双蒸水, 300μL 10 %SDS ,40 μL 蛋白酶K 溶液,300 μL 7. 5 molPL 胍盐酸液,放入70 ℃水浴30 min ,不时地摇匀。 10 000 rPmin 高速离心4 min。吸上清于2 倍体积冷无水乙醇中,轻摇至DNA 析出。用70 %冷乙醇洗 DNA 2～3 次,溶于TE 溶液。鉴定DNA。

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