国标—蛋白酶活力测定法

中华人民共和国专业 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋 白 酶 活 力 测 定 法 SB/T 10317-1999 Measurement of proteinase activity ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯 1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于 2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水 700mL,85%磷酸 50mL,浓盐酸 100mL,文火回流 10h。 取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水 50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸 15min, 以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再 煮沸除去之。冷却后,定容至 1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用时加 2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至 1000mL。 1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至 1000mL。 1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至 1000mL,即 成 0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至 1000mL,即成 0.2mol溶液(B液)。 取A 液 28mL 和B 液 72mL,再用蒸馏水稀释 1倍,即成 0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素 2g,称准至 0.002g,加入 0.1N氢氧化钠 10mL,在 水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用 pH7.2磷酸盐缓冲液定容至 100mL即 成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在 105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸 0.1000g,逐 步加入 6mL 1N盐酸使溶解,用 0.2N盐酸定容至 100mL,其浓度为 1000μg/mL,再吸取此液 10 mL,以 0.2N 盐酸定容至 100mL,即配成 100μg/mL 的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时 使 用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平: 感量 0.1mg; b. 581-G型光电比色计或 72型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1、2、5、10mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表 1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 号 试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 蒸馏水,mL ┃10 ┃ 8 ┃ 6 ┃ 4 ┃ 2 ┃ 0 100μg/mL酪氨酸,mL ┃ 0 ┃ 2 ┃ 4 ┃ 6 ┃ 8 ┃ 10 酪氨酸最终浓度,μg/ml ┃ 0 ┃ 20 ┃ 40 ┃ 60 ┃ 80 ┃ 100 ━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━ 1.3.1.2 测定步骤:取 6支试管编号按表 1分别吸取不同浓度酪氨酸 1mL,各加入 0.4mol 碳酸钠 5mL,再各加入已稀释的福林试剂 1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色 20min 在 581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用 65**#)或用 72型分光光度计进行 测定(波长 660nm)。一般测三次,取平均值。将 1～6号管所测得的光密度(OD)减去 1号管( 蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净 OD数。 为了清楚起见。再列出表格如下 (表 2)。 表 2 ━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 号 试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 按表 1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 0.4mol/L Na2CO3,mL ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 福林试剂,mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 1 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 2 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ O D值 ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 3 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 平均 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 净 O D值 ┃ 0 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━ 以净 O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度 OD所相 当的酪氨酸量 K)。 1.3.2 样品稀释液的制备。 1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉 0.100g,加入 pH7.2磷酸盐缓冲液定容至 100mL,吸取此 液 5mL,再用缓冲液稀释至 25mL,即成 5000倍的酶粉稀释液。 1.3.2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲 5g,加水至 100mL,在 40℃水浴内间断搅拌 1h,过滤,滤液用 0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。 1.3.3 样品测定: 取 15×100mm试管 3支,编号 1、2、3(做 2只也可),每管内加入样品 稀释液 1mL,置于 40℃水浴中预热 2min,再各加入经同样预热的酪蛋白 1mL,精确保温 10min, 时间到后,立即再各加入 0.4mol三氯乙酸 2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温 20min,使 残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取 15×150mm试管 3支,编号 1、2、3,每管内加入滤 液 1mL,再加 0.4mol碳酸钠 5mL,已稀释的福林试剂 1mL,摇匀,40℃保温发色 20min后进行 光 密度(OD)测定。 空白试验也取试管 3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加 0.4mol三氯乙酸 2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。 为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表 3及表 4)。 表 3 ━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━ ┃ 管 号 ┃ 试 剂 ┃ 管 号 试 剂 ┣━┳━┳━┫ ┣━━┳━━┳━━ ┃1 ┃2 ┃3 ┃ ┃(1) ┃(2) ┃(3) ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━ 预热酶液, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃预热酶液, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━ 预热 2%酪蛋白, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃0.4mol三氯乙酸, mL ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━ 作用 10min (精确计时) ┃作用 10min (精确计时)┃ ┃ ━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━ 0.4mol三氯乙酸, mL ┃2 ┃2 ┃2 ┃预热 2%酪蛋白, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━ 表 4 ━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 号 试 剂 ┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃1 ┃ 2┃ 3 ┃(1) ┃(2) ┃ (3) ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 滤 液, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 0.4mol Na2CO3,mL ┃5 ┃ 5┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 福林试剂, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ O D值 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━ 平均 O D值 ┃ ┃ ━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━ 净 O D值 ┃ ┃ 0 ━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━ 样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净 OD值。 1.4 计算 在 40℃下每分钟水解酪蛋白产生 1μg酪氨酸,定义为 1个蛋白酶活力单位。 A 1 样品蛋白酶活力单位(干基)=━━×4×N×━━━ ……………………… (1) 10 1 - W 式中:A——由样品测得 OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或 OD值×K); 4——4毫升反应液取出 1 mL测定 (即 4倍); N——酶液稀释的倍数; 10——反应 10min; W——样品水分百分含量。 1.5 注意事项 以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶, 则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的 pH 缓冲液换成相应 pH 缓冲液即可。现把几种常用 pH 缓冲液配方提供如下: 1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)0.5g以蒸 馏水溶解定容至 1000mL。 1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取 80%～90%乳酸 10.6g,加蒸馏水稀释定容至 1000mL。 B 液: 称取 70%乳酸钠 16g,加水稀释定容至 1000mL。 取 A 液 16mL与 B 液 1mL混合稀释一倍即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取 80%～90%乳酸 10.6g,以水定容至 1000mL。 B 液: 称取 70%乳酸钠 16g,蒸馏水溶解定容至 1000mL。 取 A 液 8mL与 B 液 1mL,混合稀释一倍即成。 1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂 19.08g,用蒸馏水溶解定容至 1000mL (0.05mol)。 B 液: 称取氢氧化钠 8g,用蒸馏水溶解定容至 1000mL (0.2N)。 取 A 液 250mL,B 液 215mL混合,用蒸馏水稀释定容至 1000mL即成。 1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂 19.08g,用蒸馏水定容至 1000mL 。 B 液: 称取氢氧化钠 4g,用蒸馏水定容至 1000mL 。 取 A 液与 B 液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。 2 甲醛法 成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。 2.1 仪器 a. 分析天平:感量 0.01g; b. 水浴锅; c. 电烘箱; d. 容量瓶、吸管、滴定管等。 2.2 试剂与溶液 a. 1%酚酞指示剂; b. 0.1%麝香草酚蓝; c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛(试剂配制法同氨基态氮的测定,见 ZB X 66038—87《氨 基态氮测定法》)。 2.3 操作 2.3.1 目测法 称取研细均匀的成曲样品 10g,放入 250mL锥形瓶中,加 55℃温水 80mL,充分摇匀,置于 55℃水浴锅中保温 3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至 100mL,充分摇匀后以 脱脂棉过滤,吸取滤液 10mL,移至 150mL 锥形瓶中,加水 50mL, 1%酚酞指示剂 0.2mL,以 0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH 8.2),记下滴定数作为总酸,继续加甲醛 10mL,用 0.1N氢氧化钠液滴定至深红色(pH 8.5)为终点,若再加麝香草酚蓝 1mL作指示剂,则滴至紫 红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。另称取曲 10g做水分,再折算成 干基数。 2.3.2 酸度计法 所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同 (见 ZB X 66038-87)。 2.4 计算 蛋白酶活力 (克氨基态氮/100g)(干基) (V-***Vo)×N×0.014 100 =━━━━━━━━━━×━━━ ……………………………… (2) 10 1 -W 10×━━━ 100 式中:V——加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL; ***Vo——甲醛空白滴定数, mL; W——曲水分,%; N——氢氧化钠标准溶液的当量数,N; 0.014——氮的毫克当量数。 ━━━━━━━━━ 附加说明: 本标准由商业部副食品局提出。 本标准由上海市酿造科学研究所起草。 本标准主要起草人须凤高。 ━━━━━━━━━ *本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋 白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。在培养和堆放过程, 环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。为了能和福林法的酶活力进行对照, 可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步 骤完全相同。杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水 70mL倾入 10g成曲中,并马上继续把成曲液 煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成 Vo。 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 中华人民共和国商业部 1987-11-20批准 1988-07-01实施