近代有机合成技术与方法提纯与分离

近代有机合成技术与方法分离与纯化色谱法薄层色谱法(TLC)基本原理TLC定义：把吸附剂铺在玻璃板上，将样品点在其上，然后用溶剂展开，使样品中各个组分相互分离的方法。这是一种简便、快速、微量的分离分析技术，其应用范围非常广泛。分类：吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱、分子筛薄层色谱等。吸附薄层色谱基本原理：不同物质与吸附剂（固定相）之间的吸附力不同；不同物质在溶剂（流动相）中的溶解度不同；当达到吸附和溶解（解吸）平衡时，不同的物质在固定相和流动相之间便具有不同的质量分配比或平衡常数（K）。这一过程相当于一次固—液萃取。当流动相的向前移动时，相当于固—液萃取的固液分离。流动相中因含有较多的吸附力小、溶解性大的成分，因此，相当于对此成份进行了一次富集。到达前方的各成分会在新位置于固定相和流动相之间的重新形成分配平衡。同时，原位置残留的各成分因新鲜溶剂的到来也会在原位置重新形成分配平衡。此时相当于对原材料进行二次萃取。只要移动相是连续的，那么对原位置各成分的“萃取”也就是不断的。经过多次“萃取”之后，原位置的易溶成分优先被萃取完全，残留的将是吸附力强、溶解相差的成分。这样便达到了分离的目的。分配薄层色谱的原理：相当连续多次的液—液萃取。与吸附色谱不同的是固定相和流动相均是液体，固定相的液体由其它固体材料（支持剂、载体或担体）来支持或载附，不随流动相的移动而移动。因此，物质的分离是依靠不同的物质在固定相和流动相之间以不同的分配系数（K）连续不断地形成分配平衡而实现的。物质在薄层板上移动速度常用Rf值（比移值）表示，其定义是：影响Rf值的因素：薄层的厚度吸附剂的种类、粒度、活度（吸附能力）展开剂的纯度、组成及挥发性展开方式（上行或下行）展开缸的形状、大小及饱和程度外界温度等。Rf的特性和应用：在固定条件下，特定化合物的Rf值是一个常数。因此，在条件完全相同的情况下，Rf值可以作为该化合物定性检定的物理指标，就像测定熔点或其它物理常数一样。为了获得相同的色谱条件，通常是把未知样和标准样同时滴加在同一块薄板上。（二）、吸附剂吸附色谱：►最常用的吸附剂有硅胶、氧化铝，粒度一般为150~300目筛孔，其次是聚酰胺和纤维素，其粒度一般分别为70~140目筛孔和160~200目筛孔。►氧化铝的极性比硅胶大，比较适用于分离极性较小的化合物（烃、醚、醛、酮、卤代烃等）；相反，硅胶适用于分离极性较大的化合物（羧酸、醇、胺等）。分配色谱支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素等。固定相：水、甲酰胺、石蜡油等。薄层粘合剂及其他添加剂石膏（10—15%）、羧甲基纤维素钠（CMC）（0.5—1%）、淀粉（5%）、聚乙烯醇（0.5—1%）等。添加1.5%的硅酸锌锰（Zn2SiO4∶Mn），制成荧光板。加入硝酸银可制成硝酸银薄板，用于分离含π键的顺、反异构体。添加硼酸制成的薄层板则可以分离单糖类化合物异构体。（三）、展开剂及其选择大原则：选择展开剂一般需要针对吸附剂的种类、活度和被分离混合物的组成及各成分的性质结构和性质等情况综合而定。小原则：被分离物质和展开剂之间的极性关系应符合“相似相溶原理”。该原则可用于确定展开剂的大致范围。单一溶剂的极性顺序为（从小到大）：石油醚→环己烷→四氯化碳→三氯乙烯→苯→甲苯→二氯甲烷→氯仿→乙醚→乙酸乙酯→乙酸甲酯→丙酮→正丙醇→甲醇→吡啶→乙酸混合溶剂的极性顺序（从小到大）：苯∶氯仿（1+1）→环己烷∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶丙酮（95+5）→苯∶丙酮（9+1）→苯∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶乙醚（9+1）→苯∶甲醇（95+5）→苯∶乙醚（6+4）→环己烷∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶乙醚（8+2）→氯仿∶甲醇（99+1）→苯∶甲醇（9+1）→氯仿∶丙酮（85+15）→苯∶乙醚（4+6）→苯∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶甲醇（95+5）→氯仿∶丙酮（7+3）→苯∶乙酸乙酯（3+7）→苯∶乙醚（1+9）→乙醚∶甲醇（99+1）→乙酸乙酯∶甲醇（99+1）→苯∶丙酮（1+1）→氯仿∶甲醇（9+1）四、基本操作1．薄层板的选择和铺制（1）薄板的选择最常用的薄板是玻璃板，其大小选择：根据目的、样品量、组分的数目多少和展开的方式等综合而定。小量制备：待分离组分总量在0.5～1g左右，可采用400mm×350mm的薄板1~3块即可。预试或定性分析：用单项展开时，多用载玻片（200mm×50mm，200mm×25mm或75mm×25mm）。双向展开或小量制备时，一般采用200mm×200mm或400mm×200mm的大板。玻璃板要求：平整、光滑、干净。（2）制板方法：干铺法和湿铺法干铺法概念：就是将吸附剂颗粒或粉末均匀地平铺在玻璃板上的方法，所制得薄板称为干板。吸附剂粒度要求：一般为150~200目左右。涂铺方法：把玻璃板平放在平台上或实验台面上，先将吸附剂大致平摊在玻板上，然后两手握住一根带有两个套圈的粗玻璃棒，按照图所示方向推动，把多余的吸附剂除去，便可得到一块均匀的薄板。玻棒套圈可以用塑料管或胶布等制成。两个套圈的厚度和距离，便是薄层的厚度和宽度。湿铺法概念：将溶剂或含粘合剂的溶剂和吸附剂按一定的比例，[一般硅胶为30g/(75～90)ml，氧化铝为25g/50ml]，加到一起，调成糊状，然后再将糊状物均匀的铺在薄板上的方法。湿铺法的操作步骤：①调糊硅胶G、氧化铝G、硅胶GF254或不含粘合剂的吸附剂如硅胶H、氧化铝H的充分调匀，均是取1份吸附剂，加入2~3份水。用CMC作粘合剂：0.5%羧甲基纤维素钠溶液100ml,加硅胶H（200～250目）30g或氧化铝50g，充分调匀后，即可涂铺。用淀粉作粘合剂时：取硅胶H（200～250目）0.95份，加0.05份淀粉（可溶性淀粉不能用），加水2—3份，将容器放在沸水浴上加热，不停搅拌下煮沸5分钟，直到获得最大的粘稠度，再加水1份，再煮1—2min，调匀，冷后涂铺。纤维素粉作粘合剂：纤维素粉1份，加水（或丙酮）5～6份调成糊状后涂铺。聚酰胺作粘合剂：聚酰胺1g，加6mL85%甲酸，搅拌溶解后，再加70%乙醇3mL，调匀后，便可涂铺。薄板的后处理：晾干后，活化。硅胶板一般在105℃,最高不超过128℃，烘箱中烘烤半小时，冷却后取出在干燥器中保存备用。作为分配色谱的硅胶薄层板无需活化，在室温下放置12h～24h后即可使用；氧化铝板200～220℃活化4h，得活性为Ⅱ级的板。150～160℃活化4h，得活性为Ⅲ～Ⅳ级的板。点样点样工具：微量注射器；玻璃毛细管。点样方法：液体直接点样法；固体添埋法。样点式样：点型；线型；条型。点样应注意的问题：点样斑点的大小：一般点样斑点直径不大于3mm；点样量：0.25mm薄层，一般点样量为几微克～几百微克作定性分析；2mm层厚，点样量可达几十毫克～几百毫克作制备。点样位置：距底边约1.5~2cm的起始线上，点与点之间的距离一般为1.5~2cm。4．展开/展层展开/展层的概念：展层的容器：除了专用的色谱缸外，常见玻璃标本缸、染色缸、广口瓶、大量筒、大试管等可作为其代用品。展层方式：上行法、下行法、双向法、梯次上行法。（1）上行法：有倾斜上行法或垂直上行法两种。软板则只能与平面成约15℃的近水平倾斜放置。上行法展开的距离一般为10~15cm，展开时间约为30min左右，最快者只需几分钟，最慢者需2~3h。（2）下行法：薄层样点朝上，展开剂是从上向下通过薄层。展开剂与薄层之间是通过滤纸条或纱布条作为桥梁进行转移的。由于展开剂受吸附和重力的双重作用，因此，下行法展开速度较快。（3）双向展开法：适用于方形板。先沿X轴展开，然后再换用另外一种展开剂沿Y轴展开。此法常用于某些复杂成分或Rf值较小的成分的展开，氨基酸分离就常用此法展开。（4）递次单向法/多次单向法：先用一种展开剂上行展开后，再在同一方向用同一种或换成另外一种展开剂展开，如此反复多次，可得到较好的分离效果，这种方法称为递次上行法，可适用于不易分离的化合物的分离。5．显色/检出显色/检出的概念：检出方法：物理法——紫外光照射化学法——喷洒化学试剂显色剂种类：通用显色剂；选择性显色剂；专属性显色剂。喷洒工具及方法：喷壶；喷洒显色剂要在展开剂未干之前进行，喷壶与薄层的距离应在约30～40厘米，显色后，要立即用铅笔或打头针把斑点位置标出，以便下步测量Rf值，并把薄层色谱图描绘下来。6．Rf的测量及定性、定量测定Rf值测量：斑点轮廓→斑点重心位置→斑点中心到点样原点距离→展开剂前沿到点样原点距离→Rf值计算定性分析：标准物质比较法——比较样品和标准物质在同一薄板上的Rf值；仪器分析法——将斑点物质分离出来，用仪器测定其物化性质并与已知物的物化性质比较。吸附柱色谱柱色谱是将吸附剂填充到一根玻璃管或金属管中进行的色谱技术。这种方法可以用来分离大多数有机化合物，尤其适合于复杂的天然产物的分离。适用于分离和精制较大量的样品。硅胶色谱（一）吸附剂与洗脱剂根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。1．吸附剂的要求①对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。②对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。③颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速（一般为1.5mL·min-1）通过色谱柱。④材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。2、常用吸附剂的种类：硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。3、几种常见吸附剂的特性（1）氧化铝：市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100～150目。碱性氧化铝（pH9—10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。酸性氧化铝（pH3.5—4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。中性氧化铝（pH7—7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。（2）硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。（3）聚酰胺：色谱用聚酰胺主要包括尼龙6（聚己内酰胺）和尼龙66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在16000～20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。分离对象：能与聚酰胺形成氢键的化合物，如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。聚酰胺在水中吸附能力的规律：形成氢键的基团(如：酚经基、按基、酪基、硝基等)越多，则吸附力越强。如：丁二酸＞丁酸形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小。如：芳香环、共轭双键多者吸附力大，少者吸附力小。如：若形成分了内氢键，则使化合物的吸附力减小。如：（4）硅酸镁：中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。3．吸附剂的活度及其调节吸附剂的活性取决于它们含水量的多少，活性最强的吸附剂含有最少的水。吸附剂的活性一般分为五级，分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ表示。数字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ～Ⅲ。向吸附剂中添加一定的水，可以降低其活性。反之，如果用加热处理的方法除去吸附剂中的部分水，则可以增加其活性，后者称为吸附剂的活化。4、实验操作吸附剂用量的确定→柱子的选择→装柱→柱留体积的测量→加样或拌样→洗脱→分部收集→检测→合并→浓缩硅胶：吸附色谱——1g样品/20～50g，特例1g样品/500～1000g，用前最好120ºC烘24h，可不做活性测定。分配色谱——1g样品/100～1000g，特例1g样品/10000g。色谱柱的选择：有玻璃柱和不锈钢柱两种；径长比一般为1:10～1:20，特例1:40；内壁光滑均匀，上下粗细一样，管壁无裂缝，活塞密封良好；根据吸附剂用量（体积）确定柱子的大小。装柱：有干装法和湿装法两种。干装法——在下端减压抽气的同时，将吸附剂通过长径漏斗缓缓到入柱内。湿装法——①准确加入一定体积的溶剂，然后缓慢加入吸附剂，必要时可轻敲柱壁，排除多余溶剂，计算柱留体积；②准确量取一定体积的溶剂倒入称量好的吸附剂，间歇性搅拌数次，静置过夜，次日在搅拌下装柱，计算主留体积。加样：①将样品溶于合适的溶剂，在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。最后在用少量清洁溶剂对主壁洗涤2～3次；②将样品溶于合适的溶剂后，在搅拌下加入样品量3～5倍的吸附剂，晾干至粉末状，然后在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。洗脱必须注意在洗脱的过程中，尤其是开始阶段，不能扰动层面。洗脱速度一般为每分钟流出1/200柱留体积左右。对于梯度洗脱需注意标记不同溶剂的分界管号。Theendofthissection