小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定

小容量注射剂药液微生物污染水平测试及工艺时间限度确定2013年1月丁芬* 一、概述 二、试验目的 三、试验方案 四、试验结果及讨论 五、污染菌鉴定 六、注意事项一、概述 在无菌药品的生产中，防止微生物污染一直是生产企业关注重点。无菌是注射剂的主要质量要求和安全性指标之一。按照药典进行无菌检查是存在局限性的：污染率越低，同样的取样量误将产品判为合格的概率越高；在同一个污染率下，取样量越大，以无菌实验结果判断批产品无菌的可信度就越高。一、概述 但是，对于污染率极低（如1%）的批产品，即使加大取样数，提高的可信度也是微不足道的。同时，过多的取样量也增加了实验过程的污染概率，对无菌实验结果的判断同样造成影响。从无菌药品生产的各个环节分析存在微生物污染的因素，有利于进行微生物污染控制，从而保证药品的无菌水平。一、概述 药品生产质量管理规范（2010年修订）无菌药品附录第五十七条应当尽可能缩短药液从开始配制到灭菌（或除菌过滤）的间隔时间。应当根据产品的特性及贮存条件建立相应的间隔时间控制标准。二、试验目的 在一定的条件下，微生物将根据时间成几何级数的增长，因此“微生物污染水平监测”实质也是一种时间间隔管理的实施方法。我们通过检测药液稀配后至灭菌前生产过程不同时段药液的微生物数量，建立微生物随时间的变化趋势关系，找到达到污染控制限度的时间点，预留一定的安全时间作为内部控制时限要求。二、试验目的 无菌药品灭菌与灭菌前产品的微生物污染程度有关，对灭菌前微生物污染状况进行检控是对产品作无菌评价的先决条件。本次试验模拟生产品种：XX注射液，规格：5ml，生产批量：12万支，灌装时间：8h，灭菌：6柜次。二、试验目的 除了微生物相关要求外，必须指出，部分产品在溶液或其他状态下存在不稳定性，极易降解，产生新的杂质，因此基于药品化学稳定性的时间管理，也是确定存放时限的制定依据。三、试验方案 （一）成立试验小组，明确职责 1、小组成员： 组长：质量负责人 成员：QA、QC、针剂车间 2、职责 2.1组长负责审批。三、试验方案 2.2QA 负责起草试验方案和报告 试验过程取样和环境监测（生产全过程沉降菌和生产前中后尘埃粒子、风速、温湿度）。 负责协调工作，以保证按规定项目顺利实施。 负责现场监督。 负责数据及结果的审核。三、试验方案 2.3QC 微生物检验实验的准备及测试工作。 负责根据检验结果出具检验报告单。 2.4针剂车间 负责指定操作人员和清洁人员。 负责按照生产工艺规程和操作SOP进行操作。三、试验方案 （二）确定风险点 无菌检查并不能保证最终灭菌产品的无菌状态。应当把成品的无菌检查看做确保无菌的一系列控制措施中的最后一项措施。因此，灭菌前产品的微生物控制应当作为生产中最重要的质量保证措施和正常生产的先决条件。三、试验方案 我公司XX小容量注射剂为最终灭菌制剂，5ml生产线关键生产工艺流程为：称量、浓配、超滤、稀配定容、过滤（微生物负载滤器）、除菌过滤、灌装、灭菌检漏。三、试验方案三、试验方案 经过分析，对成品无菌可能产生影响的关键点为稀配液微生物污染水平，包括稀配结束时的稀配液、灌装完成过程的稀配液、灌装即将结束时的稀配液；灌装液微生物污染水平，包括灌装开始时的灌装药液、灌装过程的灌装药液、灌装即将完成时的灌装药液；灭菌前药液微生物污染水平。三、试验方案 （三）制定取样计划 本次试验计划模拟灌装的时间为8小时，根据灌装机的灌装能力，确定生产批量为12万支，灭菌6柜次，按照xx注射液工艺规程组织生产。对生产当天的注射用水进行微生物限度检查，生产环境进行监测：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面微生物（生产结束）三、试验方案 1、取样点及取样频次 样品1：稀配罐内的稀配液，自稀配定容结束后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生物量 样品2：除菌过滤之前的药液，即自微生物负载滤器过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量三、试验方案 样品3：灌装后的药品，即除菌过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量 样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长的药液，取第一锅和最后一锅分别检测微生物量 样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最后一锅待灭菌时间最长的药液，灭菌程序启动后再放置一小时后检测微生物量三、试验方案三、试验方案三、试验方案 2、样品标签三、试验方案 3、依据标准及相关文件 《药品GMP指南》无菌药品 《药品生产验证指南》2003年版 《中华人民共和国药典》2010年版 《XX注射液工艺规程》三、试验方案 《现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术》 4、取样器具 取样瓶为250ml无菌玻璃磨口瓶。三、试验方案 （四）检验方法 采用薄膜过滤法进行药液的微生物限度检查。取滤膜孔径0.45μm，直径为75mm的一次性全封闭薄膜过滤器（北京牛牛基因技术有限公司，滤器类型：NS01-75D1），将过滤器逐一插放在滤液槽座上，将其塑胶软管装入集菌仪的蠕动泵的管槽内，注意定位准确，软管走势顺畅。三、试验方案 其进液软管的双芯针头插入供试液容器的塞上，开启集菌仪，将供试液容器倒置，使药液均匀通过滤器，滤净。打开过滤器菌面朝上贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。四、试验结果及讨论 （一）微生物污染水平检测结果见下表四、试验结果及讨论 样品1：稀配罐内的稀配液，稀配定容后至生产结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间变化的趋势图如下：四、试验结果及讨论四、试验结果及讨论 讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时在稀配罐分别取样进行微生物限度检查，在第5小时后开始检出微生物，数量为8cfu/100ml，随时间增长微生物数量呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物数为369cfu/100ml。四、试验结果及讨论 根据颇尔的除菌过滤器的过滤效果的验证，理论上定容后的药液的载菌量为：6.0×1010cfu，（除菌过滤器至少能达到107/cm2过滤面积浓度的缺陷假单胞菌，过滤面积为0.6m2）在除菌过滤器的除菌能力范围内。我公司工艺验证规定微生物限度检查结果应小于10cfu/ml。 我们通过检测稀配罐药液在生产过程不同时段药液的微生物数量，8小时可以作为稀配液污染控制限度的时间点。四、试验结果及讨论 样品2：除菌过滤之前的药液，即自微生物负载滤器过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间变化的趋势图如下：四、试验结果及讨论四、试验结果及讨论 讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时对0.22μm微生物负载过滤器过滤后的药液分别取样进行微生物限度检查，在第6小时后开始检出微生物，并随时间增长呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物量为7cfu/100ml，符合除菌过滤前药液小于10cfu/100ml微生物负荷要求。四、试验结果及讨论 我们通过检测除菌过滤前的药液在生产过程不同时段的微生物数量，8小时可以作为除菌过滤前药液污染控制限度的时间点，可以将7小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。四、试验结果及讨论 样品3：灌装后的药品，即除菌过滤后的药液，自灌装开始至灌装结束，每隔1小时取样检测一次微生物量，微生物量随时间变化的趋势图如下：四、试验结果及讨论四、试验结果及讨论 讨论：第0、1、2、3、4、5、6、7、8小时灌装药液分别取样进行微生物限度检查，在第7小时后开始检出微生物，并随时间增长呈上升趋势。在生产即将结束时检测药液的微生物数为50cfu/100ml，药品的载菌量为2cfu/支。符合100cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。四、试验结果及讨论 我们通过检测灌装药液在生产过程不同时段的微生物数量，8小时可以作为灌装药液污染控制限度的时间点，可以将6小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。四、试验结果及讨论 样品4：灭菌前药液，即灭菌前放置时间最长的药液，第一锅灭菌前药液微生物数量为0，第六锅灭菌前药液微生物数量为37cfu/100ml，符合100cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。四、试验结果及讨论 样品5：待灭菌药液放置1小时后，取第一锅和最后一锅待灭菌时间最长的药液，灭菌程序启动后再放置一小时后检测微生物量，第一锅待灭菌放置1小时后微生物数量为3cfu/100ml，第六锅待灭菌放置1小时后微生物数量为118cfu/100ml，已经超过100cfu/100ml的灭菌前药液的微生物数量。四、试验结果及讨论 我们通过检测灭菌前药液和待灭菌药液放置1小时后的药液的微生物数量，9小时可以作为稀配至灭菌污染控制限度的时间点，可以将7小时作为预留的安全时间作为内部控制时限要求。四、试验结果及讨论 污染控制限度的时间点和内部控制时限汇总表四、试验结果及讨论 确定微生物污染内部控制内部时限：稀配定容至灌装结束时限为6小时，灌装开始至灭菌结束时限为7小时，每次最长待灭菌时限为3小时。四、试验结果及讨论 （二）其他检测结果 生产当天的注射用水微生物限度检查结果0，标准10cfu/100ml，符合规定。 灌装间生产环境：温度、湿度、尘埃粒子（生产前、生产过程、生产结束）、风速（生产前、生产结束）沉降菌（生产全过程），人员5指手套，接触碟表面微生物（生产结束）结果均符合规定。四、试验结果及讨论 （三）最终成品检验情况 成品按照灭菌柜次检验无菌和热原，结果均符合规定。五、污染菌鉴定 微生物鉴定程序（参见《现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术》P205） （一）原则 微生物鉴别应遵循逐步缩小范围的原则，用细菌分类学的知识和操作步骤，一步一步的将未知微生物逐步落实到科、属，然后选择相应的数码鉴定系统将未知微生物鉴定到种。五、污染菌鉴定 鉴定包括以下几个环节：1、菌株采集；2、菌株纯化；3、菌落形态学观察如形状、大小、色泽；4、细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式；5、革兰染色反应，阳性或阴性；6、氧化与发酵试验；7、接触酶与氧化酶试验；8、鞭毛与动力等等。五、污染菌鉴定 通过上述基础实验结果再结合细菌鉴定检索表从而确定微生物所属范围，并选择合适的数值分类鉴别试验条（API试验条）将微生物鉴定到种。五、污染菌鉴定五、污染菌鉴定 细菌鉴定检索表包含细菌鉴定时所涉及的基本定向生化鉴别试验，根据这些定向生化试验能为大部分未知菌的鉴定选择合适API试纸条。五、污染菌鉴定 如何根据这张鉴定表来选择所使用方法的步骤： 1、纯化、分离待鉴定菌 无菌操作用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如：TSA）划线分离，以纯化至单菌落。 2、挑取纯化后单菌落做革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。五、污染菌鉴定 3、如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。 4、如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用APIStrep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用APIStaph试剂条进行鉴定。五、污染菌鉴定 5、假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用APICoryne或其他试剂条进行鉴定。 6、表中未列出的其他试剂条 API20A试剂条可用于鉴定厌氧菌。API20CAUX试剂条可用于鉴定酵母菌。五、污染菌鉴定 7、选定正确的试剂条后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。五、污染菌鉴定 （三）革兰染色试验 在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验称为基本定向生化试验。介绍革兰染色实验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。五、污染菌鉴定 1、原理 由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以致关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色；五、污染菌鉴定 而革兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当用酒精脱色时，脂类物物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。五、污染菌鉴定 2、染色液的配制 2.1结晶紫染液 将A液（结晶紫2.0g溶于20ml95%乙醇中）与B液（草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水）混合，静置48小时后过滤。五、污染菌鉴定 2.2卢戈碘液 取碘化钾2.0g溶于5ml蒸馏水中，再加入碘片1.0g，待碘全部溶解后，加蒸馏水至300ml即成。也可只加蒸馏水至100ml，配制母液储存，用时加两倍蒸馏水。 2.3脱色液 95%乙醇溶液。五、污染菌鉴定 2.4复染液（0.25%的沙黄液） 取沙黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。 3制片、染色操作 在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹混匀成1cmX1cm大小区域的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。五、污染菌鉴定 滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并立即用水冲净。滴加沙黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。五、污染菌鉴定 4阳性-阴性对照控制 取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液，制成细菌涂片；或是使用已知的革兰阳性细菌和阴性细菌制成涂片，分别染色操作后作为阳性和阴性的对照控制。 5镜检观察 在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。六、注意事项 1、小容量注射剂5ml生产线处于正常生产状态。 2、因为是工艺试验的批次，生产结束后应立即进行彻底的清场，必要时进行清洁灭菌后的效果确认。六、注意事项 3、试验过程中相关活动必须详细真实记录，如具体的取样时间，进行检测的时间等，样品取样和检验需编号管理，要求及时正确标识清晰。取样注意按计划进行，避免样品的漏取和错标。 4、样品应及时传递，QC第一时间安排进行微生物限度检查。*