第三章人工授精技术

韩雪蕾一、人工授精技术的定义二、人工授精技术的优越性三、人工授精技术的技术程序四、精液的保存技术五、人工授精技术与胚胎移植技术的关系六、牛繁殖技术进展人工授精技术是利用器械采集雄性动物的精液，经检查和处理后，再用器械将精液输入到发情雌性动物的生殖道内，以代替自然交配而繁殖后代的一种技术。人工授精技术经历了三个发展阶段：试验阶段生产性实用阶段冷冻精液阶段二、人工授精技术的优越性：提高优良种公畜的配种效能和种用价值，扩大配种头数牛：自然交配——1：40～1：100头/年，AI——1：6000～1：12000头/年。大幅度减少种公畜的头数，降低饲养成本加速家畜品种改良，促进育种工作进程防治各种疾病，特别是生殖道传染病的传播（布氏杆菌病，衣原体感染，沙门氏菌病，病毒性腹泻）有利于提高母畜的受胎率克服公母畜体形悬殊而出现的交配困难，克服“无障碍配种”有利于种质交流和扩大配种地域年份方法年均产奶量1946本交1900kg/头1966人工授精技术3826kg/头1986人工授精技术+冷冻精液5846kg/头三、人工授精技术的技术程序人工授精技术的技术程序：采精精液品质检查精液稀释精液的分装精液的保存（液态保存、冷冻保存）精液的运输精液的解冻与检查输精概括来说，动物人工授精技术由采精技术、精液处理技术和输精技术三大部分组成。1.采精家畜的采精方法：假阴道法适用于各种家畜（犬除外）。手握法适用于猪。按摩法适用于禽类、犬科动物（对不能站立的牛也可用）电刺激采精法适用于野生兽类的采精方法，（常需用氯胺酮等镇静剂保定，但采出的精液往往射精量大而精子密度很低；对某些动物如家兔只能引起阴茎强直性勃起而不射精）。2.精液品质检查：（1）常规检查：射精量，色泽，气味，云雾状，pH值（2）精子活率（3）精子密度（4）死活精子百分率⒉定期检查⑴精子计数（亿/毫升）⑵死、活精子百分率测定⑶精子畸形率测定⑷精子顶体完整率的测定3.精液稀释⒈营养剂：功能作用。主要是糖类（果糖、葡萄糖等单糖）以及卵黄和奶类（鲜全奶、脱脂奶或纯奶粉）等。⒉保护剂：⑴缓冲剂：保证精液适宜PH值，利于精子的存活。如柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等。⑵抗冷保护剂：如新鲜卵黄、奶类。⑶抗冻保护剂：可以提高精液冰点，少量渗入精子可降低冷冻损伤（减少冰晶形成），从而达到抗冻作用，如甘油和二甲基亚砜（DMSO，对精子的毒性较大）⑷抗菌素类：抑制精液中和操作中带入的微生物的繁殖。如青霉素、链霉素、硫酸新霉素、林肯霉素、氨苯磺胺（结晶磺胺即外用消炎粉）等。四、精液的保存技术精液保存的目的是为了延长精子在体外的存活时间，并通过远距离运输扩大精液的使用范围，便于长途运输。精液的保存按照保存温度可分为常温保存、低温保存和冷冻保存三种。（一）液态精液的保存技术1.常温保存常温保存法就是将稀释后的精液置于15~25℃温度范围内保存，亦称为室温保存或变温保存。目前，主要应用于猪精液的保存。猪精液的保存温度为15℃～20℃。保存原理*常温保存主要是利用一定范围的酸性环境抑制精子的活动，或用冻胶环境来阻止精子活动，以减少其能量消耗，使精子保持在可逆性的静止状态而不丧失受精能力，在精液稀释液中加入弱酸类物质。*常温有利于微生物的生长，因此，还要用抗菌物质抑制微生物对精子的有害影响。此外，加入必要的营养和保护物质，隔绝空气，也会有良好的作用。保存方法通常采用隔水降温处理，先将精液与稀释液在30℃同温下，按一定比例混合后，分装在贮精瓶内，密封后放入30℃温水容器内，然后在同容器放进15~25℃温水保温瓶内保存。保存时要防止温度上升，保持相对稳定。也可将贮精瓶直接放在室内、地窖或自来水中保存。保存期限：一般为数天（牛1～5d，马2～5d，猪3～5d，绵羊1d）。2.低温保存低温保存法就是将稀释后的精液置于0~5℃的低温条件下进行保存。保存原理*低温保存主要是在抗冷剂的保护下，防止精子冷休克，缓慢降温至0~5℃保存，利用低温来抑制精子的活动，降低代谢和能量消耗，抑制微生物生长，同时加入必要的营养和其他成分，并隔绝空气，以达到延长精子存活时间的目的。保存方法冬季置于不结冰的室内（温度要符合要求）其它季节可放在冰箱内或加有凉水的保温瓶内保存。如果没有冰源，也可用化学制冷降温，或吊入水井深处保存。精液低温保存的注意事项降温速度不可过快（通常按0.2℃/min）。保存期间，尽量使温度保持恒定，避免升温。低温保存的精液在镜检和使用前，要通过水浴升温到30℃以上。低温保存的猪精液在镜检和使用前，必须升温并伴以充氧）。（二）冷冻精液的保存技术冷冻保存就是将精子在-79℃干冰或－196℃液氮中保存。目前精液保存应用最广泛的是冷冻保存，在家畜生产中具有重要的使用价值。（二）冷冻精液的保存技术1.精液冷冻保存原理精子具有受温度变化直接影响其本身活动力和代谢能力的生物学特性。精液经过特殊处理后，保存在超低温下，精子的代谢活动完全受到抑制，其生命在静止状态下长期保存下来，当温度回升后又能复苏，且具有受精能力。精子在冷冻过程中，在抗冻保护剂的作用下会尽可能形成玻璃化，防止了精子细胞内水分的冰晶化所造成的破坏作用。（二）冷冻精液的保存技术2.冷冻精液的制作技术冻精剂型及其优缺点：细管精液：将稀释后的精液平衡后利用分装机分装于0.25～0.5ml剂量经过标记的无毒塑料细管中，封口冷冻后制成。每个输精剂量有效精子数不少于1000万。（有效精子0.1亿/0.25ml。全球通用）。优缺点：细管冷冻精液需要专门的机器操作，打印、分装、封口、冷冻一次完成。细管型精液剂量准确，卫生条件好，质量稳定，冻后活力高，使用方便，还可以减少在空气中或在液氮保存中的污染，输精时利用专门的输精枪，不需解冻液，直接解冻便可应用。其缺点是，全套机器价格昂贵，小型冻精站不便推广。颗粒冻精：颗粒型冷冻精液是发展中国家和我国普遍采用的一种类型。颗粒型冻精是将稀释、平衡后的精液在-80～-120℃下冻结成颗粒状，每个颗粒为0.1毫升，解冻后的输精剂量有效精子数不少于1200万。优缺点：颗粒型冷冻精液最大优点是，冷冻时不需很多设备，冻后贮存方便；缺点是手工操作，易造成污染。安瓿（ampoule）冻精：是操作比较简单的一种类型。将稀释后的精液分装于0.5～1ml的玻璃安瓶中，每个输精剂量有效精子数不少于1500万，平衡后进行冷冻。优缺点：优点是操作比较方便，不易被污染；但标记麻烦，贮存时占用体积大，现在已逐渐被颗粒型和细管型所替代。各种动物的冻精剂型：牛、羊：细管精液，颗粒冻精，安瓿冻精马属动物：大颗粒状。猪：大颗粒状或饼状。其他动物：颗粒冻精。五、人工授精技术与胚胎移植技术的关系人工授精技术是胚胎移植技术成功的关键一环决定了是否受精，因此是卵母细胞形成胚胎的关键技术这两项技术分别是充分利用优良公畜和母畜的具有里程碑意义的技术1．方法：由开张器法到直肠把握输精，情期受胎率提高了10%～15%。2．部位：子宫颈深部→子宫体→排卵侧子宫角（受胎率提高幅度不大）。1．输一次即可。必要时隔12～18h复配一次。2．输精量：细管精液1支，或颗粒冻精1粒（解冻液1～1.5ml）、鲜精1～1.5ml。每个剂量应含有效精子数：液态精液0.2亿～0.5亿，颗粒冻精≥0.12亿/粒，细管精液≥0.1亿/支。水牛一般在发情开始后24～48h或于排卵前约6h输精一次，必要时间隔8～12h再输一次，其余的不变。（三）自动工厂化细管冷冻精液生产工艺的应用。MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1714315079782_0化的生产，提高了冻精的产量、质量（菌落数量减少），增加经济效益。（四）种公牛科学饲养管理全价日粮、合理的饲养方式、适宜的环境、日常保健、合理调教等措施的采用，延长利用时限（北京种公牛站由63月龄→98月龄）。奶牛育种过程中，对产奶量高强度选择使高产奶牛繁殖力下降，特别表现在产后发情延迟、早期胚胎死亡、流产及子宫疾患。（一）定时发情和输精针对产后发情表现不明显、安静发情，卵巢活性差的母牛。LRH-A320μg诱导卵泡液中的卵泡排卵形成黄体，7d后注射PGF2α3mg溶黄体，诱导发情，2d后注射LRH-A320μg，16～20h后输精。受胎率与对照组差异显著。（二）促进黄体功能hCG的应用：周期5d或14～16d注射hCG1000～1500IU，诱发副黄体，辅助妊娠干扰素τ的抗溶黄体作用（妊娠信号）。促生长因子、生长素（GH）、胰岛素和类胰岛素生长因子（IGF-1）等的促早期胚胎发育防退化作用。（一）X、Y精子的分离1．仪器的改进和效率的提高流动细胞分类检索仪经改进，目前效率达到每小时分离X、Y精子各1000万（一个输精剂量）。实用标准为100个剂量/h。用无毒的荧光染料与精子DNA结合。由于X-精子和Y-精子的DNA含量不同（X精子DNA含量比Y精子高3.8%），所发出的荧光量也不同。这样，通过计算机控制，使发荧光量不同的精子带上不同的电荷（X-精子带正电荷，Y-精子带负电荷）。最后，在精子通过高压电场时，带不同电荷的精子发生偏斜而进入不同的收集管内。2．提高分离精子利用效率的途径低精液量输精：500万～200万有效精子。分离鲜精输精。小剂量200万/支，用于体外单一性别胚胎的生产。单精注射（ICSI）。（二）胚胎性别鉴定：PCR检测法是目前唯一的、常规的、最具有商业应用价值的鉴定胚胎性别的方法。1．减少取样对胚胎的损伤2．缩短检测时间3．防止假阳性（一）工艺进一步成熟：移植前对胚胎质量的检查和筛选、受体选择、饲养管理和同期化程度，部分生产应用达到30%以上的受胎率。（二）分离精子体外雌性胚胎的生产（三）活体采卵效率的研究B超活采仪活体采集的牛卵母细胞卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱