饲料木聚糖酶的开发

饲料木聚糖酶的开发 饲料木聚糖酶的开发 近年来，随着人们对畜产品品质安全卫生的要求，开发使用高品质无毒、无害和无污染残留的绿色饲料添加剂已成为我国饲料工业面临的一个紧迫问题。中国饲料产量位居世界第二，然而饲料资源并不丰富，其中能量饲料缺口较大，据预测2020年将达0.83亿吨[1]。规模化养殖的发展，使充分利用非常规饲料资源成为畜牧业长期、持续和健康发展的关键。我国长期以玉米为主要能量饲料原料的现状造成玉米供应日趋紧张，因此必须充分地开发利用资源丰富的麦类、谷物和糠麸。但麦类、谷物和糠麸等副产品中都存在抗营养因子——阿拉伯木聚糖，限制了其在饲料中的大量应用。 随着生物技术的发展，饲用酶制剂和微生物制剂的产量得到了快速增长，质量也有了显著提高，酶制剂可以提高饲料利用率、促进动物生长、改善生态环境和防治动物疾病，避免了由于添加抗生素、激素和高铜等物质所产生的负面影响，具有明显的经济效益和积极的环保意义。我国饲料行业，在配合饲料中除一般玉米—豆粕型日粮，实际上更多的情况是在玉米—豆粕型日粮基础上可能加入10％~40％的大麦或小麦、次粉、麦麸、统糠、棉粕等非常规饲用原料，这使得木聚糖酶在饲料工业中占有重要地位[2]。另外，中国已加入WTO，国外低价格小麦、大麦产品的涌入，将进一步刺激木聚糖酶的市场需求。添加以木聚糖酶为主的饲用酶制剂，消除抗营养因子的抗营养作用，市场前景极为广阔。 1 木聚糖酶的营养作用及其在动物营养中的应用 木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是半纤维素中含量最丰富的一种，约占细胞干重的35％[3],是谷物籽实中的主要非淀粉多糖(NSP)之一，它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面，进而影响动物的消化吸收，降低了饲料的营养价值。木聚糖酶类是专一降解木聚糖的一类，它在生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业中有着广泛的应用[4]，具有很大的商业开发价值。它可以破坏植物细胞壁结构，提高内源性消化酶的活性，提高饲料养分的利用率；降解可溶性多糖，降低其粘性；减少胃肠道疾病，增进动物健康；减少粘粪和脏蛋，降低空气中有害气体浓度，减少环境污染[5]。饲料工业中添加木聚糖酶可以为畜禽生产带来良好的生产效果和经济效益。许多试验表明，添加木聚糖酶可以提高畜禽的生产性能[6-8]。但也有效果不明显甚至没有效果的报道。这些资料显示生产成绩与日粮类型和动物生理条件等因素间存在相关性[9，10]。  2 木聚糖酶的结构特点和生化特性 对不同来源的木聚糖酶的研究已证实了木聚糖酶的多样性[11]。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各种酶相互协同完成,其中内切木聚糖酶是最关键的水解酶。以氨基酸序列相似性和疏水簇分析法为基础，Henrissat和Bairoch(1993,1996)[12]将糖基糖苷键水解酶中的内切木聚糖酶分为10族和11族，这相当于Gilkes(1991)[13]等分类的第F家族和第G家族，它们分别组成高分子量和低分子量的木聚糖酶。10族内切木聚糖酶主要包括酸性和大分子的内切木聚糖酶，而碱性的和小分子的内切木聚糖酶则属于11族。在结构上木聚糖酶有催化结构域、底物结合结构域、热稳定结构域、Cellulosome-Docking结构域、连接区域、重复序列和其它未知功能的非催化结构域以及催化结构域[14]，不同的木聚糖酶含有其中的一个或一个以上的区域。   细菌和真菌的β-1，4-木聚糖酶多数为单亚基蛋白，对于不同生物来源的木聚糖酶，分子量(Mr)范围为8~145kD，pH范围为3~10.5，稳定pH范围为3~10，多数酶的最适pH范围为4~7，最适温度为40~60℃。根据酶的理化特性，可分为两大类，即Mr小于30kD的酶和Mr大于30kD的酶。70％的酸性β-1,4-内切木聚糖酶Mr在30kD以上，而碱性β-1,4-内切木聚糖酶Mr则多在30kD以下。通常细菌可产生两种木聚糖酶，即低Mr的碱性木聚糖酶和高Mr的酸性木聚糖酶，但真菌通常只产生低Mr的碱性木聚糖酶[15]。 3 饲料木聚糖酶的开发途径 木聚糖酶要广泛经济高效的应用于饲料工业应具备一定条件。众所周知，猪胃中的pH一般为2~3.5，十二指肠、空肠和回肠的pH范围分别为4~6、5.5~6.7和7.0~7.5[16]，因此要求饲用木聚糖酶在pH较广的范围内能保持较高的活性。另一方面，现在颗粒料制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度在75~93℃，多数木聚糖酶在此高温下会大幅度地丧失活性[17]；同时，饲料中的木聚糖酶最终的作用场所是猪正常体温(37℃)的胃肠中，因此能耐制粒高温，且在动物正常体温下具有较高活性成为木聚糖酶在生产中应用的关键。 目前，在饲料工业中使用的酶制剂基本上是由微生物发酵生产的，发酵结束后获得的含酶发酵液需要经过一系列后处理操作，分离菌体，加工成干物质，或者加入各种稳定剂才能应用在饲料生产中。在饲用酶的应用中，稳定性是影响应用效果的重要因素。目前已经可以通过改进生产 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 如加盐、制备包被型含酶颗粒等使木聚糖酶的稳定性得以提高[18-21]，但是主要的技术指标——发酵酶活在很大程度取决于产酶菌种的性能和酶本身，目前普遍采用的包被等技术不能从根本上提高酶的热稳定性，而基因工程和蛋白质工程的发展为改造木聚糖酶特性提供了新手段。 3.1 木聚糖酶基因克隆与表达的研究概况 到目前为止，已有近百种不同菌株的木聚糖酶基因被克隆或表达出来，其中细菌来源的木聚糖酶克隆较多，但真菌来源的木聚糖酶克隆很少。这些研究多采用大肠杆菌为宿主菌[22]，也有以酵母、木霉、曲霉等真核生物为受体细胞的[17]，而所运用的载体及限制酶则形式多样。克隆的木聚糖酶基因一般使用自身所携带的启动子在受体菌中表达，但是酶的表达水平比在原始菌株中下降了许多，原来能分泌到细胞外的酶也只有少数在新的受体中能继续维持分泌性能。由于克隆的木聚糖酶基因表达水平比在原始菌株中低，从有利于生产及进一步提高表达水平的角度出发，许多科学家尝试利用分泌性的芽孢杆菌、链霉菌、曲霉等作为生物反应器[23]，并使用具有高效表达启动子的载体构建新型高效表达基因工程菌，不仅提高了酶活性，而且有些木聚糖酶能分泌到胞外[24]。一般采用CaCl2处理法或电穿孔法将重组质粒转化到受体细胞，用RBB木聚糖(Remazol Brilliant Blue-Xylan)平板进行筛选，也有利用与可可碱酸钠偶联的木聚糖(AZCL-Xylan)为底物进行检测的，还有的用刚果红染色进行筛选。 3.2 蛋白质工程改造木聚糖酶 蛋白质工程是在重组DNA 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 用于“操纵”蛋白质结构之后发展起来的一个分子生物学分支，它通过修饰蛋白质的基因或改变结构来获得具有新特性的蛋白质[25]。人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计(rational design)，在蛋白质空间结构和功能研究的基础上，设计一个新的具有人们所期待性质的蛋白质氨基酸序列，然后通过对编码该蛋白质的基因进行定位突变或盒式突变，再用遗传工程的方法产生出预期的新的蛋白质。但蛋白质结构的复杂性极大地增加了难度，况且多数要改造的蛋白质我们并不清楚其结构，不能进行合理设计。而随着分子遗传学的发展，作为非合理设计（irrational design)的分子定向进化策略可冲破这一局限性[26]，可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下，在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)。通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选，获得具有改进功能或全新功能的蛋白质，使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现，在蛋白质结构改造中具有极大的潜力。 3.2.1 定点突变技术 定点突变技术是利用合成的寡核苷酸作诱变物，根据设计的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，在已知的核苷酸序列中准确地改变蛋白质氨基酸编码中一个或数个碱基，改变组成蛋白质的一个或数个氨基酸残基，以研究蛋白质的结构与功能的关系。 人们从嗜热性微生物如细菌、真菌和放线菌中发现了许多木聚糖酶，它们具有很高的热稳定性，且其催化结构域有较大同源性。以催化结构域的保守残基分析为基础进行定点突变改变木聚糖酶性质，如酶活性，热稳定性，pH值稳定性等，这些酶在工业生产上的应用具有十分重要的意义。Georis等[27]建立了木聚糖酶xyl1和TfxA的分子模型，这两种木聚糖酶分别来自于中温菌Streptomyces sp.S38和嗜热菌Termomonospora fusca，都属于第11家族的木聚糖酶。比较了这2种木聚糖酶的三维结构，并将TfxA酶中的嗜热结构用定点突变法引入xyl1酶中，以提高其最适反应温度和热稳定性。将xyl1的11位的苏氨酸残基突变为酪氨酸(T11Y)，从而在第11位酪氨酸和第16位酪氨酸之间(Y11-Y16)建立一个和TfxA酶一样的新的芳香族氨基酸相互作用，结果突变酶的最适温度由原来的60℃提高到70℃，57℃时酶的热稳定性比原来提高了6倍。进一步对突变的酶分子xyl1进行结构分析发现，Y11和Y16分别位于β链的β1和β2上。它们之间的相互作用增加了xyl1分子氨基末端的稳定性。Roberge等[28]用定点突变法研究Streptomyces lividans木聚糖酶A的His86残基对酶热稳定性的影响，用定点突变法将His86分别突变成6种其它的氨基酸残基，所有这些突变都使酶的热稳定性大大降低。可见，His86是木聚糖酶A耐热必需的氨基酸。Tumnen等[29]报道将Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一个α-螺旋的162位谷氨酰胺突变为组氨酸或酪氨酸后半衰期提高到63min。他们还研究了该酶的活性中心表面增加精氨酸残基后对酶活和酶的稳定性的影响[30]，将5个精氨酸残基引入到“Ser/Thr表面”(Ser/Thr surface)中，结果Ser/Thr表面的精氨酸使酶在较高的温度下的活性提高了，在有底物的情况下，木聚糖酶在60~65℃时的热稳定性提高了4~5倍。原因可能是精氨酸的引入使得离子键的数目增加，从而增加了酶的pH和热稳定性。Moreau等（1999）[31]用定点诱变技术将Streptomyces lividans 1326的木聚糖酶XYLA中的Arg156变成Glu，结果R156E的特异性酶活性提高了10％至25％，最适温度比野生型提高了5℃，半衰期提高了6min，提高幅度为47%，而突变酶酶反应的pH性质与天然酶相同。 3.2.2 引入二硫键 研究发现，在酶蛋白中引入半胱氨酸，从而增加酶蛋白中二硫键的数量可以增加某些酶的稳定性，但不影响酶的活性。Tumnen等[33]报道将Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一个α-螺旋中的110位丝氨酸和154位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸，从而在110位和154位建立一个二硫键， 65℃时的半衰期从不到1min增加到14min。1994年，Wakarchuk等[34]在木聚糖酶分子中引入不影响其活性的二硫键，使其耐热性提高了15℃。  3.2.3 蛋白质体外定向进化 蛋白质(或酶)的体外定向进化(directed evolution of protein or enzyme in vitro)，又称分子进化(molecular evolution)，就是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外对蛋白质(或酶)基因进行随机诱变，用一定的筛选或选择方法定向选出所需性质的突变酶。目前已发展出多种定向进化的策略，如易错PCR(erro-prone PCR)、DNA重排(DNA shuffing)、体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination,PRP)、交错延伸(stagger extension process，StEP)等[35，36]。其中DNA改组技术，又称有性PCR(sexal PCR)，在蛋白质的体外定向进化中起着重要的作用，它不仅可以加速积累有益突变，而且可以使酶的两个或更多的已优化性质合为一体[37]。  4 前景与展望 综上所述，木聚糖酶具有广泛的工业应用价值，开发木聚糖酶可以缓解我国饲料资源的不足，变废为宝，提高饲料的可消化性和动物的生产性能。随着技术的不断发展，可以通过改进生产工艺，利用基因工程、蛋白质工程等生物技术手段，来高效地生产高酶活、适应性、抗逆性强的木聚糖酶，以实现其低成本、产业化的商品生产。而对木聚糖酶在各种动物不同时期饲喂不同日粮时作用模式的研究，酶的最佳用量和最佳活力环境的确定、酶活性测定方法的统一以及我国饲料中木聚糖含量数据库的建立都是我们以后还需努力的方向[3]。总之，木聚糖酶必将在未来的畜牧业发展中，发挥出其所具有的巨大潜力和作用。