适用于新型免疫技术的高浓度流感疫苗制备

适用于新型免疫技术的高浓度流感疫苗制备 Spectrum Laboratories, INC. 对由流感病毒感染引起的季节性传染病常采用疫苗进 行预防。典型的季节性流感疫苗由 3种病毒株组成， 包括来自 A型流感 H1N1和 H3N2亚型的 2种抗原， 以及 B型流感的一种抗原，并通过肌肉注射接种。由 于每年病毒株均会变化，疫苗通常需在较短的时间内 生产、配送和接种，如何缩短各阶段时间是疫苗预防 的一个重要挑战，此外，传统疫苗主要通过注射器注 射接种，需专业人员进行操作，如何简化接种方式也 是一个研究热点。 对于突发性传染病，在保证疫苗免疫原性和稳定性的 前提下，迫切需要可加快疫苗配送和接种的方法，已 有多种技术进入研发阶段，包括粉剂或液体吸入剂、 可溶性微针、用于皮内接种的带针头载药注射器、以 及用于口服接种的稳定流感疫苗，但将这些技术投入 实际应用，都必须对现有的标准肌肉注射疫苗进行工 艺更改，其中一个重要难题是如何获得高浓度的抗原。 流感亚单位疫苗的生产主要通过裂解病毒，纯化流感 血凝素（HA）来进行。不同病毒株原液的 HA浓度会 有差异，一般为 0.2-0.5mg/ml。但使用新型接种技术时， 可能需要更高的 HA浓度（一般需达 20mg/ml），以达 到有效人体剂量。已有研究使用直流过滤或平面膜包 式错流过滤进行抗原浓缩，但不是滞留体积过大，就 是难以规模放大。 使用中空纤维切向流过滤是进行流感抗原浓缩的高 效、高稳定技术，且易于规模放大，浓缩工艺不会影 响抗原的稳定性，并可保留其免疫原性。 操作步骤 切向流过滤浓缩 HA 实验采用 KrosFlo® 研发用 IIi切向流过滤系统（产品编 号：SYR2-U20-01N）对季节性流感病毒原液进行浓缩， 配用 MWCO 30kD（HA分子量约为 70kD）的改性聚 醚砜中空纤维过滤器（膜表面积 115cm2，产品编号： D02-E030-10-N）。 过滤器通过 Masterflex® #14软管连接到 KrosFlo® 一 体式蠕动泵和数字压力监测器。在入口、出口及滤 液端口通过直接头或 T 型接头连接聚砜压力传感 器（产品编号：ACPM-499-03N）。回流软管配用自 动背压阀（产品编号：ACPC-F16-01N）。 系统运行前，检测是否存在泄漏，并使用 1× PBS 测量流路滞留体积。上样前，先用 1× PBS预湿并 冲洗流路 20-30min，滤液端口打开，流速控制为 60ml/min。然后，将进样和回流管路连接至原液（进 样）容器，将滤液管路连接至滤液容器。打开滤液 管路，系统起始运行流速设置为 120ml/min，剪切 力范围为 3000-5000S-1，同时监测滤液体积（或质 量）。浓缩过程在预先设定的 8.0 psi 跨膜压（TMP） 条件下运行（已对 2-12psi不同跨膜压值进行测试）。 浓缩完成后，将跨膜压缓慢降至 0，关闭滤液管路。 滞留在管路中的料液通过反转泵运行方向排出。测 量最终的总滤液体积，并根据起始原液体积计算浓 缩因子。实验最终将流感病毒原液浓缩 50-80倍。 浓缩液检测 使用 BCA法检测浓缩液中的蛋白质，评估浓缩工艺对 样品的损耗，同时使用体积排阻色谱法（SEC）检测 蛋白质的聚集。此外，通过 SDS-PAGE 检测浓缩后抗 原是否有降解，并使用单向免疫扩散法（SRID）以及 反向高效液相色谱法（RP-HPLC）检测抗原的稳定性 和完整性。而对于浓缩后样品的免疫原性，使用小鼠 免疫试验结合血凝抑制实验及 ELISA实验进行检测。 结果及讨论 冷链物流和新型免疫技术的发展给流感疫苗的研发带 来了更多的可能性，但要将理念付诸现实仍面临诸多 挑战，而制备稳定的高浓度 HA 原液将是重要的先决 步骤。 使用 TFF 进行 HA 浓缩是一种相对简单的方法，且可 以方便地对工艺进行规模放大，如使用 115cm2的过滤 器，即可处理 200ml-4L 的料液，HA 终浓度可达到 14-28mg/ml，约为原液的 50-80倍。 进行 TFF 处理时，料液沿膜表面切向循环流动，与死 端过滤相比，更适合连续型处理应用，且不易形成滤 饼层。而这项技术更大的优势是工艺的简单线性规模 放大，以完成大体积批量料液的浓缩处理；当然，也 可以选用小规格的过滤器，降低滞留体积（最低可至 1ml），以用于研发规模小体积料液的处理。只要稍作 优化，TFF 几乎可用于所有蛋源性或细胞源性流感抗 原的浓缩，也可以降低不同病毒株间因纯度、疏水性、 HA 特性或可溶性聚集而产生的浓缩结果的差异。 抗原质量检测显示，HA在 TFF 过程中及处理后都 保持稳定。SRID 分析显示，TFF 处理后，抗原保 持结构和功能性完整，同时浓缩液中的 HA维持功 能活性，抗原与特异性抗体的结合不受 TFF浓缩处 理的影响，SEC结果显示，浓缩过程没有发生明显 的聚集行为。SDS-PAGE 实验中，没有发现因 HA 降解而形成的低分子量蛋白条带。将浓缩抗原保存 4周仍保持稳定，这有利于后续的工艺处理。同时， 免疫学研究显示，浓缩后的抗原保留其免疫原性。 由于每年流感病毒流行株的抗原都会发生变化，所 有可能需要对工艺进行一定的优化，确保工艺重复 性，并维持浓缩抗原的效价和免疫原性。除流感疫 苗外，我们相信这种浓缩技术也可以用于其它的疫 苗抗原，以达到新型免疫技术所需的浓度。 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 中空纤维切向流过滤是一种用于高浓度流感抗原 制备的稳定工艺技术，可轻松实现规模放大，更重 要的是，在整个处理过程中，抗原保持稳定和免疫 原性。对于特性和纯度水平每年都会发生变化的流 行性/季节性病毒抗原，这种稍作优化即可广泛适 用的技术非常值得推广，对于新型免疫技术的发展 也将起到重要的促进作用。 参考文献： 1) Kommareddy, S., Bonificio, A., Gallorini, S., et al., Preparation of Highly Concentrated Influenza Vaccine for Use in Novel Delivery Approches. Journal of Pharmaceutical Science, 2012. 2) Dormitzer, P., Tsai, T., Del Giudice, G., New technologies for influenza vaccines. Hum Vaccin Immunother, 2012. 3) Van Reis, R., Goodrich, EM., Yson, Cl., et al., Membrane separations in biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 2001. Spectrum Laboratories, INC. 中空纤维过滤器组件 For Use of Spectrum and Authorized Distributor.