分子生物学课件重点整理__

第二章 染色体与DNA 染色体（chromosome）是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。 真核生物的染色体在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。 染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位—核小体(nucleosome)成串排列而成的。 原核生物(prokaryote) ：DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。 染色体由DNA和蛋白质组成。 蛋白质由非组蛋白和组蛋白（H1,H2A,H2B,H3,H4） DNA和组蛋白构成核小体。 组蛋白的一般特性：P24 ①进化上的保守性 ②无组织特异性 ③肽链氨基酸分布的不对称性：碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。 ④组蛋白的可修饰性:甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 ⑤ H5组蛋白的特殊性：富含赖氨酸（24%）(鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5) 组蛋白的可修饰性 在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。 所有这些修饰作用都有一个共同的特点，即降低组蛋白所携带的正电荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变染色体的结构，直接影响转录活性；二是核小体表面发生改变，使其他调控蛋白易于和染色质相互接触，从而间接影响转录活性。 2、DNA 1) DNA的变性和复性 ■变性（Denaturation) DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。 ■增色效应(Hyperchromatic effect)在变性过程中，260nm紫外线吸收值先缓慢上升，当达到某一温度时骤然上升，称为增色效应。 ■融解温度（Melting temperature ，Tm ) 变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。 生理条件下为85-95℃ 影响因素：G+C含量，pH值，离子强度，尿素，甲酰胺等 ■复性（Renaturation)热变性的DNA缓慢冷却，单链恢复成双链。 ■减色效应（Hypochromatic effect) 随着DNA的复性，260nm紫外线吸收值降低的现象。 2) C值反常现象（C-value paradox) C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。 （四）核小体(nucleosome)：用于包装染色质的结构单位，是由DNA链缠绕一个组蛋白核[（H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚体】构成的。 1、原核生物基因组结构特点 ● 基因组很小，大多只有一条染色体 ● 结构简炼 ● 存在转录单元(trnascriptional operon) ●多顺反子(polycistron) 重叠基因由基因内基因、部分重叠基因、一个碱基重叠组成。 2、真核生物基因组结构特点 ●真核基因组结构庞大 3×109bp、染色质、核膜 ●单顺反子 ●基因不连续性 断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、 外显子(exon) ●非编码区较多 多于编码序列(9:1) ● 含有大量重复序列 ■ 不重复序列/单一序列：在基因组中有一个或几个拷贝。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。如：蛋清蛋白、血红蛋白等 功能：主要是编码蛋白质。 ■ 中度重复序列：在基因组中的拷贝数为101～104。如：rRNA、tRNA 一般是不编码蛋白质的序列，在调控基因表达中起重要作用 ■ 高度重复序列：拷贝数达到几百个到几百万个。 ●卫星DNA：A·T 含量很高的简单高度重复序列。 1、 DNA的一级结构：指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序， DNA序列是这一概念的简称。碱基序列 2）特征： ●双链反向平行配对而成 ●脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA骨架，碱基排在内侧 ●内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：T，C：G）。 2、DNA 的二级结构：指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。 2）分类： 右手螺旋：A-DNA，B-DNA 左手螺旋：Z-DNA 3、DNA的高级结构：指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。 2）主要形式：超螺旋结构（正超螺旋和负超螺旋） （一）DNA的半保留复制（semi-nservative replication） 1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 3、DNA半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。 （二）与DNA复制有关的物质 1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA 3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物 4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶 ●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物 ●反应需要有模板的指导 ●反应需要有3(-OH存在 ●DNA链的合成方向为5 ( ( 3 ( 性质 聚合酶Ⅰ 聚合酶Ⅱ 聚合酶Ⅲ 3' 5 '外切活性 + + + 5' 3 '外切活性 + - - 5' 3'聚合活性 + 中 + 很低 + 很高 新生链合成 - - + 聚合酶Ⅰ主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。 聚合酶Ⅱ修复紫外光引起的DNA损伤 聚合酶Ⅲ DNA 复制的主要聚合酶，还具有3→5’外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性 6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用 7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)： 拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的ε蛋白 拓扑异构酶Ⅱ：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶 8、DNA 解螺旋酶 /解链酶（DNA helicase)：通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。 rep蛋白沿3 ’(5’移动，而解螺旋酶I、II、III沿5 ’ (3’移动。 9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 （三）DNA的复制过程（大肠杆菌为例） · 双链的解开 · RNA引物的合成 · DNA链的延伸 · 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 1、双链的解开------ ftju制有特定的起始位点，叫做复制原点。 ori(或o）、富含A、T的区段。 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子 复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉 双链解开、复制起始P44 大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合 在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链 解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链 2、RNA引物的合成 DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。 引物长度约为几个至10个核苷酸， 3、DNA链的延伸 DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication)：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。 在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。 在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成5((3 (的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。 4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止） 当复制叉遇到约22个碱基的重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus蛋白复合物能使DnaB不再将DNA解链，阻挡复制叉继续前移。P47 在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链 （四）复制的几种主要方式 P42 1、双链环状、θ型复制、双向等速 2、滚环型： （1）模板链和新合成的链分开; （2）不需RNA引物，在正链3‘－OH上延伸 （3）只有一个复制叉; 3、D环复制---单向复制的特殊方式如：动物线粒体DNA （五）真核生物中DNA的复制特点 1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子（约150bp左右）； 2、复制叉移动的速度较慢（约50bp／秒），仅为原核生物的1／10。 3、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 4、真核生物有多种DNA聚合酶。 5、真核生物DNA复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。（真核冈崎片段长约100-200bp，原核冈崎片段长约1000-2000bp。） （六）原核和真核生物DNA的复制特点比较 1 复制起点（ori）：原核一个，真核多个； 2 复制子 ：原核一个，真核多个； 3 复制子长度：原核长；真核短； 4 复制叉：原核多个；真核多个； 5 复制移动速度：原核较快；真核较慢； 6 真核生物染色体在全部完成复制前，各起始点的DNA 复制不能再开始。而在 快速生长的原核生物中，复制起点上可以连续开始新的DNA复制。 7 原核生物染色体的复制与细胞分裂同步，可以多次复制；真核生物染色体的复制发生在S期，是细胞分类的特定时期，而且仅此一次。 四、DNA的修复 DNA修复系统 功能 错配修复 恢复错配 碱基切除修复 切除突变的碱基 核甘酸切除修复 修复被破坏的DNA DNA直接修复 SOS系统 修复嘧啶二体或甲基化DNA DNA的修复，导致变异 1、错配修复 （mismatch repair） ●Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化 ●甲基化紧随在DNA复制之后进行（几秒种后至几分钟内） ●根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基 2、碱基切除修复 excision repair 所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶，它能特意切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变 · 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 · 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对 · 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对 3、核苷酸切除修复 1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位 2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸 3） DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链 4）DNA连接酶将切口补平 4 、DNA的直接修复 在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体 甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对 SOS反应 (SOS response)：是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的 一种应急措施。 · 包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。细胞癌变也与SOS反应有关。两个作用（1）DNA的修复；（2）产生变异 五、 DNA的转座 DNA的转座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposable element) 介导的遗传物质重排现象。 转座子（transposon Tn）：存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。 已经发现“转座”这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是它的拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA复制。 原核生物转座子的类型： 1、插入序列(IS) IS是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。 2、复合转座子(composite transposon) 复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列 3、TnA家族 · TnA家族没有IS序列、体积庞大 (5000bp以上)、带有3个基因，其中一个编码β-内酰胺酶(AmpR)，另两个则是转座作用所必须的。 (三）转座作用的机制 · 转座时发生的插入作用的普遍特征，是受体分子中有一段很短的(3～l2bp)、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 · 对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。 · 靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性DNA末端。 （三）转座作用的遗传学效应 p63 （1）转座引起插入突变（2）转座产生新的基因（3）转座产生的染色体畸变（4）转座引起的 生物进化 反转录转座子（retrotransposon）：指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。 第三章 生物信息的传递（上） ——从DNA到RNA 转录(transcription) ：生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。 参与转录的物质 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA 酶: RNA聚合酶 其他蛋白质因子 RNA合成方向：5' 到 3' 转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。 与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。 DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。 转录单元（transcription unit）一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。 二、参与转录起始的关键酶与元件 （一） RNA聚合酶 ●原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）---全酶=核心酶+ σ因子 亚基 基因 相对分子量 亚基数 组分 功能 α rpoA 36500 2 核心酶 核心酶组装， 启动子识别 β rpoB 151000 1 核心酶 β和β'共同形成 RNA合成的活性中心 β' rpoC 155000 1 核心酶 ω ？ 11000（需查） 1 核心酶 ？ σ rpoD 70000 1 σ因子 存在多种σ因子， 用于识别不同的启动子 真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较 酶 位置 转录产物 相对活性 对α-鹅膏蕈碱的敏感性 RNA聚合酶Ⅰ 核仁 rRNA 50-70% 不敏感 RNA聚合酶Ⅱ 核质 hnRNA 20-40% 敏感 RNA聚合酶Ⅲ 核质 tRNA 约10% 存在物种特异性 RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别   RNA聚合酶 DNA聚合酶 大小(M) 大，4.8×105dol 小，1.09×105dol 引物 无 有 产物 较短，游离 较长，与模板以氢键相连 作用方式 一条链的某一段 两条链同时进行 外切酶活性 无 5’ 3’，3’ 5’ 校对合成能力 无 有 修复能力 无 有 （二） 启动子(promoter) 启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开） TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号 转录起点---与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。 真核生物启动子的结构 核心启动子（core promoter） ●定义：指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区 ●作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始 2、上游启动子元件 ●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等 ●作用：控制转录起始频率。 （三） 转录起始复合物---二元闭合复合物、二元开链复合物、三元复合物。（原核） 三、转录的基本过程 1、起始位点的识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。 RNA聚合酶全酶((2(((()与模板结合 2、转录起始 ①RNA聚合酶全酶((2(((()与模板结合 · DNA双链解开 · 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物 5(-pppG -OH + NTP ( 5(-pppGpN - OH 3( + ppi 转录起始复合物: RNApol ((2(((() - DNA - pppGpN- OH 3( 3、RNA链的延伸 ● (亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移； ●在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。 注意：9个核苷酸以前还在启动子区，容易脱落，一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区，转录正式进入眼神阶段。 4、转录终止 终止子（terminator）：位于基因的末端，在转录终止点之前有一段回文序列（反向重复序列）约6-20bp。 真核生物终止: 由一段特定序列5′－AATAAA－3′和回文序列（反向重复序列）组成。 分为两类： ●强终止子－内部终止子：不依赖Rho (ρ)因子的终止。 ●弱终止子 －需要ρ因子（rho factor），又称为ρ依赖性终止子（ Rho-dependent terminator） 不依赖(因子的终止 当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。 终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构； 在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3’端为寡聚U 发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。 依赖(因子的终止 (因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。 （二）、真核生物的转录过程 1. 转录起始 真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。 （1）. 转录起始前的上游区段 · 顺式作用元件(cis-acting element)：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。 例： 启动子、增强子、弱化子等 · 增强子：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。但不是启动子的一部分。特点：1.远距离效应；2.无方向性；3.顺式调节；4.无物种和基因的特异性；5.具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增强子可以对外部信号产生反应。 （2）. 转录因子：能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。 参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ --TFⅡD、 TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、TFⅡH （3）转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC) 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。 （4）模板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 2. 转录延伸 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。 3. 转录终止—— 和转录后修饰密切相关。 四、转录后加工 5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的编辑 1、在5’端加帽 5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5’端的这种结构称为帽子（cap）。 帽子结构功能： ①能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合； ②m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5’末端，以保护mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。 2、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---AAUAAA： ★准确切割。。★加poly（A） 多聚腺苷酸尾巴功能： 提高了mRNA在细胞质中的稳定性。 3、RNA的剪接 生物体内内含子的主要类型： U-AG、AU-AC、Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子Ⅲ类内含子 参与RNA剪接的物质： snRNA（核内小分子RNA）、snRNP（与snRNA结合的核蛋白） 、核内RNA（U1、U2、 U4、U5、U6） 4、RNA的编辑 · 编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。 五、原核生物与真核生物mRNA的特征比较 1、原核生物mRNA的特征 ● 半衰期短 ● 多以多顺反子的形式存在 单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。 多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。 Z： β-半乳糖苷酶Y： 透过酶A：乙酰基转移酶 ZYA为结构基因 ● 5’ 端无“帽子”结构， 3’ 端没有或只有较短的poly（A ）结构。 ● SD序列：原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区。mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。P85 2、真核生物mRNA的特征 “基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。 ● 5’ 端存在“帽子”结构 ●多数mRNA 3’ 端具有poly（A ）尾巴（组蛋白除外） ●以单顺反子的形式存在 六、RNA合成与DNA合成异同点 相同点： 1、都以DNA链作为模板 2、合成的方向均为5’→3’ 3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3’,5’-磷酸二酯键，使核苷酸链延长。 不同点：   复制 转录 模板 两条链均复制 模板链转录 （不对称转录） 原料 dNTP NTP 酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 产物 子代双链DNA （半保留复制） mRNA， tRNA， rRNA 配对 A-T；G-C A-U；T-A；G-C 引物 RNA引物 无 第四章 生物信息的传递（下） —从mRNA到蛋白质 翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。 蛋白质合成的场所是核糖体。 蛋白质合成的模板是mRNA 模板与氨基酸之间的接合体是tRNA 蛋白质合成的原料是20种氨基酸 一、遗传密码¡ª¡ª三联子 （一）三联子密码：mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码(triplet coden) 。 ●至1966年，20种氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部被查清。 （三）遗传密码的性质 1、 连续性 编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。 基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。 从mRNA 5(端起始密码子AUG到3(端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF)。 2、简并性 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。 3、通用性与特殊性 蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。 4、摆动性 转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，这种现象称为密码子的摆动性。 二、tRNA的结构、功能与种类 （一） tRNA的结构 1、二级结构：三叶草形2、三级结构： “L”形 （二） tRNA的功能 1、解读mRNA的遗传信息 2、运输的工具，运载氨基酸 tRNA有两个关键部位： ● 3’端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。 ●与mRNA结合部位—反密码子部位 tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。 1、起始tRNA和延伸tRNA 能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。 真核生物：起始密码子AUG 所编码的氨基酸是Met，起始AA-tRNA为Met-tRNAMet。 原核生物：起始密码子AUG 所编码的氨基酸并不是 甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet 2、同工tRNA 代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。 同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别（P119）。 3、校正tRNA 无义突变校正tRNA：可以通过改变反密码子区校正无义突变 错义突变校正tRNA：通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。 无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。 错义突变：由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子，这种基因突变叫错义突变。 GGA（甘氨酸） AGA（精氨酸） 四、氨酰-tRNA合成酶 · AA- tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，它既能识别tRNA，又能识别氨基酸，对两者都具有高度的专一性。 三、核糖体的结构与功能 核糖体是由rRNA（ribosomal ribonucleic acid）和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的。 细菌是70s{50s\30s} 哺乳动物是80s{60s\\40s} （二）核糖体的功能： 合成蛋白质 在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。 ●mRNA结合部位——小亚基 ●结合或接受AA-tRNA部位（A位）——大亚基 ●结合或接受肽基tRNA的部位——大亚基 ●肽基转移部位（P位）——大亚基 ●形成肽键的部位（转肽酶中心）——大亚基 四、蛋白质合成的过程(生物学机制） · 氨基酸的活化 · 翻译的起始 · 肽链的延伸 · 肽链的终止 · 蛋白质前体的加工 (一)氨基酸的活化 原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨酸 起始AA-tRNA是：fMet-tRNAfMet 真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸 起始AA-tRNA是：Met-tRNAMet (二)翻译的起始 原核生物（细菌）为例： 所需成分：30S小亚基、 50S大亚基、模板mRNA、 fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+ 翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、 翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成3步： （P129） 1. 核蛋白体大小亚基分离 2、30S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合。 3.在IF-2和GTP的帮助下， fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。 4、带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。 真核生物翻译起始的特点 ●核糖体较大,为80Ｓ； ●起始因子比较多； ● mRNA 5′端具有m7Gppp帽子结构 ● Met-tRNAMet ● mRNA的5′端帽子结构和3′端polyA都参与形成翻译起始复合物； 真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物) 原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物（P131）。 (三)肽链的延伸 肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括：AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。 延伸因子(elongation factor, EF) ： 原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)、 EF-G 真核生物：EF-1 、EF-2 1、AA-tRNA与核糖体A位点的结合需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子 2、肽键形成：是由转肽酶/肽基转移酶催化 3、移位：核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子。 需要消耗GTP，并需EF-G延伸因子 A位点是新到来的氨酰-tRNA的结合位点。 P位点是肽酰- tRNA的结合位点。 E位点是延伸过程中释放tRNA的位点，即，去氨酰-tRNA通过E位点脱出，释放到核糖体外的胞质中。 （四）肽链的终止 RF1：识别终止密码子UAA和UAG 终止因子 RF2：识别终止密码子UAA和UGA RF3：具GTP酶活性，刺激RF1和RF2活性，协助肽链的释放 真核生物只有一个终止因子（eRF） (五)蛋白质前体的加工 1、N端fMet或Met的切除 2、二硫键的形成 3、特定氨基酸的修饰 磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化 4、切除新生肽链中非功能片段 （六）蛋白质折叠 由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三位构象，从而表现出生物学活性或功能。 新生多肽→一级结构→二级结构→三级结构已经具有活性→（对于寡聚蛋白需要组装称为四级结构才有活性。 (七)蛋白质合成抑制剂 · 青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。被广泛用于人类医学。 · 氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。氯霉素有时也用于治病，但剂量和周期受到较严控制。 五、蛋白质的运转机制 1、翻译-运转同步机制 2、翻译后运转机制 (1)线粒体蛋白质跨膜运转 (2)叶绿体蛋白质的跨膜运转 3、核定位蛋白的运转机制 4、蛋白质的降解 ¶*蛋白质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开，蛋白质需要运转。 ¶*核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所，任何时候都有许多蛋白质被输送到细胞质、细胞核、线粒体和内质网等各个部分，补充和更新细胞功能。 ¶*细胞各部分都有特定的蛋白质组分，蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。 ¶*细胞中蛋白质的合成：绝大多数在细胞质中合成；一小部分在细胞器（叶绿体和线粒体）中合成。 ¶*定位于细胞器内的大部分蛋白质在细胞质中合成，细胞器内合成的留在细胞器内。 ¶*蛋白质插入或穿过生物膜的过程称为蛋白质运转（protein translocation）。 蛋白质运转的两种方式 翻译-运转同步（co-translational translocation） ◆是即将进入内质网的蛋白质的易位方式； ◆蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合； ◆蛋白质合成时，核糖体定位于内质网表面，称膜结合核糖体(membrane-bound ribosome）。 ◆分泌蛋白质大多是以同步机制运输的 翻译后运转（post-translational translocation） ◆蛋白质翻译完成后从核糖体上释放，然合扩散至合适的靶膜并与运转装置结合。 ◆蛋白质合成时，其核糖体不与任何细胞器相连，称游离核糖体(free ribosome) ◆在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。 ◆参与生物膜形成的蛋白质，依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内。 蛋白性质 运转机制 主要类型 分泌 蛋白质在结合核糖体上合成，并以翻译-运转同步机制运输 免疫球蛋白、卵蛋白、 水解酶、激素等 细胞器发育 蛋白质在游离核糖体上合成，以翻译后运转机制运输 核、叶绿体、线粒体、 乙醛酸循环体、过氧化物酶 体等细胞器中的蛋白质 膜的形成 两种机制兼有 质膜、内质网、类囊体 中的蛋白质 1、翻译-运转同步机制 信号肽假说 ●信号肽：能启动蛋白质运转的任何一段多肽。（常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端））。 ●绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽。 ●信号序列特点： （1）一般带有10-15个疏水氨基酸； （2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸； （3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。 ●信号肽假说内容： （1）蛋白质合成起始首先合成信号肽 （2）SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停 （3）SRP与SRP受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始 （4）信号肽进入膜结构 （5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行 （6）蛋白质完全过膜，核糖体解离 信号肽与蛋白质转运的关系P144 （1）完整信号肽是保证蛋白质转运的必要条件； （2）仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发生； （3）信号序列切除并不是转运所必需； （4）并非所有运转蛋白质都有可降解的信号肽。 蛋白质翻译运转同步运输的基本过程 可分两个阶段： 首先：带有新生肽链的核糖体与膜结合； 然后：新生肽链进入膜通道并易位。 核糖体与膜结合需要信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP）。 SRP有两种能力： ◆结合新合成的分泌型蛋白的信号序列； ◆结合位于膜上的 SRP 受体。 2、翻译后运转机制 前导肽及其特性: ﻇ 翻译后跨膜易位的蛋白质，前体一般含前导肽(leader peptide)，前导肽在跨膜运转中起重要作用。 ﻇ 过膜后，前导肽水解，蛋白质变为有功能的蛋白质。 前导肽的一般特性： （1）带正电荷碱性氨基酸（Arg）较丰富， 分散于不带电荷的氨基酸序列之间； （2）缺少带负电荷的酸性氨基酸； （3）羟基氨基酸（Ser）含量较高； （4）有形成两亲（亲水和疏水）α- 螺旋能力。 线粒体蛋白质跨膜运转 · Hsp70为分子伴侣 · 分子伴侣：结合在一些不完全装配或不恰当折叠蛋白上，帮助它们折叠或防止它们聚集的蛋白质。 · 分子伴侣的生物学功能 · (1)帮助新生蛋白质正确折叠 · (2)纠正错误折叠或介导其降解 · 泛素活化酶 (ubiquitin - activating enzyme，E1) · 泛素结合酶（ubiquitin - conjugating enzyme，E2) · 泛素蛋白连接酶(ubiquitin -proteinligating enzyme, E3) E1,E2,E3的作用： · E1激活泛素分子， · E2就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。 · E3能识别被降解的蛋白质。 第五章 分子生物学研究法 ﹡重组DNA技术-基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 ﹡分子杂交及相关技术 ﹡聚合酶链式反应的原理和应用 ﹡DNA多态性及其 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 · 基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。 · 基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。 · 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。 1、理论上的三大发现 · 遗传物质主要是DNA · DNA的双螺旋结构和半保留复制机制 · 遗传密码子的破译 2、技术上的三大发明 · 限制酶和连接酶体外切割和连接DNA片断 · 质粒改造成载体以携带DNA片断克隆 · 逆转录酶的使用 ①常用的工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 ②载体 vector · 自我复制 · 克隆载体、表达载体 原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13） 真核载体：动物病毒载体pLXSN 载体的条件 · ( 分子小（( 10 Kb） · ( 有限制酶酶切位点 · ( 可自主复制 · ( 有足够的copy数 · ( 带筛选的标志 1982年 -- 转基因小鼠 1997年 克隆绵羊“多利” 1998年 -- 克隆鼠 2001年2月 -- 人类基因组 · 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 · 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 · 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。 · 基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。 · 基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。 · 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。或者说基因操作技术服务于基因工程。 一、限制酶 · 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 · 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 1、限制酶的命名 · 命名原则：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 · EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 2、限制酶的特点： （1）. 限制性内切酶一般识别完全的回文结构，它具有两个基本特点： 　① 能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对； 　② 两条互补链的5’—3’的序列组成相同，即将一条链旋转180度，则两条链重叠。 （2）. 识别４-8个相连的核苷酸组成的特定核甘酸序列。 （3） 切割方式有两种 　① 错位切割，产生互补性的粘性末端。 错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。 　②  沿对称轴切割，产生平齐末端 切割后，DNA末端的一条链多出一至几个核苷酸，成为突出末端，又称粘性末端包括3’突出、5’突出。 切割两条链时产生两端平整的DNA分子，称为平末端。 （4） 具有同裂酶 来源不同的限制性内切酶识别同样的核甘酸靶序列。 如：BamH I和Bst I具有相同的识别序列GGATCC。 （5） 具有同尾酶 来源各异，识别的靶序列也不同，但却产生相同的黏性末端，故同尾酶产生的黏性末端可以连接起来，但一般不能再被原来的任何一种酶所切割。 如：Taq I、Cla I和Acc I为一组同尾酶，其中任何一种酶切割DNA分子都产生5′端CG凸出的粘性末端。 二、目的基因及载体 （一）目的基因 （一）目的基因的获得 1）化学合成法： 较短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物、测序引物、定点突变、核酸杂交探针 1）DNA 的化学合成 单链DNA短片段的合成已成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术。 · 化学合成DNA分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5’端，而在细胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。 · 整个DNA的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行，并且可以对合成过程进行计算机控制。 · 目前常用的化学合成DNA的方法是磷酰胺法。 2）基因组文库和cDNA 文库 基因库，也叫基因组文库， DNA文库（ DNA library) 是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。 将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的“图书馆”中查找（没有 目录 工贸企业有限空间作业目录特种设备作业人员作业种类与目录特种设备作业人员目录1类医疗器械目录高值医用耗材参考目录 ）。 cDNA文库 首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。 cDAN文库和基因组文库的不同之处在于，cDNA文库除却了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便于DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。 主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出来。 组建一个cDNA文库的步骤： 1)分离表达目的基因的组织或细胞 2)从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA 3）第一条cDNA链的合成，需要RNA模板，cDNA合成引物，逆转录酶，4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。 4)第二条cDNA链的合成 5) cDNA的甲基化和接头的加入 6)双链cDNA与载体的连接 （二）载体 · 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 · 载体具以下特征： · 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；（质粒大于15kb时，其将外源DNA转入大肠杆菌的效率将大大降低。） · 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； · 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 · 4）可以在载体细胞中独立复制，即本身是一个复制子。 基因工程载体的分类 根据载体的分子生物学特性划分 （1）. 质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制（质粒DNA载体）。如：质粒载体 （2）. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒。如：噬菌体载体 （3）.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性。如：柯斯质粒载体 用于原核生物宿主的载体目前已构建应用的基因工程载体主要有： 质粒载体、 噬菌体载体、 柯斯质粒载体。 （一）.质粒（plasmid ）：质粒是细胞染色体或核区DNA外能够自主复制的很 质粒载体特点 1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2、 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3、 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 (注：前三个特点必不可少。 1、 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 2、 标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） 2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） 3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr） 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） 三　DNA重组基本程序 · 1.分—载体和目的基因的分离 · 2.切—限制性内切酶的应用 · 3.接—载体与目的基因连接成重组体 · 4.转—基因序列转入细胞 · 5.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 · 6.表－目的基因在宿主细胞的表达 目的基因的获取方法：从基因组中提取、CDNA法、化学合成法、PCR法。 鉴定得到的目的基因的鉴定方法：抗性选择、提取质粒电泳鉴定大小、快速提取酶切鉴定、菌落杂交法、DNA序列分析。 第二节 分子杂交及相关技术 分子杂交： 是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程. 分子杂交包括：DNA-DNA杂交（原位杂交、点杂交、Southern杂交），DNA-RNA杂交（Northern杂交）及蛋白杂交（Western 杂交）等。 一、杂交探针（Probe）的获得 · Probe：探针，是由放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记后，能与目的基因片段特异性杂交的已知序列的核酸片段。 · 根据探针的来源及核酸性质