FACSCanto流式细胞仪原理

BD公司(ɡōnɡsī)介绍BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在纽约创立的,总部位于(wèiyú)美国新泽西州第一页，共79页。BD公司(ɡōnɡsī)介绍位居财富周刊500强的大型跨国公司产品涵盖诸多医疗(yīliáo)领域生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材第二页，共79页。BD公司(ɡōnɡsī)流式细胞仪产品FACSVantageSE-大型(dàxíng)分选机FACSAria-高速(ɡāosù)分选的台式机FACSDiva-高速分选的数字化大型机第三页，共79页。BD公司(ɡōnɡsī)流式细胞仪产品FACSCount流式细胞仪FACSCalibur流式细胞仪FACSCantoII流式细胞仪第四页，共79页。BD公司(ɡōnɡsī)流式细胞仪产品BDFACSCantoII流式细胞仪第五页，共79页。FACSCantoII流式细胞仪原理(yuánlǐ)第六页，共79页。流式细胞(xìbāo)仪可告诉我们一个细胞(xìbāo)的什么指标?细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC）细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向(cèxiànɡ)散射光信号，SSC）相关的荧光强度第七页，共79页。散射光信号(xìnhào)的特征FSC和SSC当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射(sǎnshè)。与激光束方向同轴的称前向角散射(sǎnshè)光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。488nm激光激发产生散射(sǎnshè)光第八页，共79页。前向角散射光信号(xìnhào)FSC第九页，共79页。侧向(cèxiànɡ)角散射光信号SSC第十页，共79页。散射光信号(xìnhào)的特征红细胞裂解(lièjiě)的全血第十一页，共79页。荧光信号(xìnhào)的特征什么是荧光信号当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级(néngjí)，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。第十二页，共79页。荧光信号(xìnhào)的特征发射光的荧光(yíngguāng)强度与结合的位点成正比第十三页，共79页。信号(xìnhào)产生荧光(yíngguāng)信号第十四页，共79页。荧光信号(xìnhào)的特征常见荧光(yíngguāng)染料的发射波长第十五页，共79页。直方图显示(xiǎnshì)荧光信号第十六页，共79页。点图显示荧光(yíngguāng)信号第十七页，共79页。什么(shénme)是流式细胞仪？在流动的状态中检测细胞各种物理(wùlǐ)及生物特征的一种仪器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第十八页，共79页。流式细胞仪特点(tèdiǎn)及检测标本特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱(xǐtuō)液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液第十九页，共79页。FACSCantoII流式细胞仪系统(xìtǒng)组成流式细胞仪液流车工作站第二十页，共79页。FACSCanto简介(jiǎnjiè)配置(pèizhì)空冷激光两根激光:488nm、633nm、光路固定，无需调校液流系统信号检测系统八角形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号电子系统将电信号转换成数字化信号第二十一页，共79页。液流系统(xìtǒng)流动室鞘液工作液，可选PBS、血球(xuèqiú)稀释液或蒸馏水。样本流单细胞悬液，浓度51051106/mL第二十二页，共79页。液流系统(xìtǒng)鞘液是压力驱动的。在压力作用下，鞘液经过滤器进入流动室下部的小室中。检测的样本在压力的作用下，也进入流动室下部的小室中，样本压力略大于鞘液的压力。在鞘液的包裹下，样本由下向上通过流动室，经激光激发(jīfā)后，样本中的颗粒被检测。第二十三页，共79页。液流系统(xìtǒng)-FLOWCELL(流动室)InjectorTip荧光信号聚焦的激光光束鞘液第二十四页，共79页。液流系统(xìtǒng)第二十五页，共79页。液流系统-样本(yàngběn)流速第二十六页，共79页。样本流速(liúsù)的选择高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集(cǎijí)速度快,但分辨率低.低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。第二十七页，共79页。光学系统第二十八页，共79页。光学系统染色的细胞或其他颗粒通过聚焦的激光束时，会散射激光或荧光。因为激光束是一个小斑点，颗粒快速通过流动室，散射光或荧光持续的时间非常短-只有几微秒。这些短暂的光信号(xìnhào)被收集、过滤然后被检测器转换成电信号(xìnhào)。第二十九页，共79页。信号(xìnhào)采集系统激光488nm，633nm，激发样本中的颗粒或细胞产生散射光信号和荧光信号信号检测组件-八角形和三角形光学滤片将激光激发后产生的散射光信号和荧光信号引导(yǐndǎo)至相应的PMTPMT-将光信号转换成电信号第三十页，共79页。常用(chánɡyònɡ)荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途(yòngtú)颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色PerCP488670免疫荧光深红APC633670免疫荧光红色PI488620DNA染色橙红ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红第三十一页，共79页。常用荧光(yíngguāng)染料(488nm,633nm激发)FluoresceinIsothiocyanate(FITC)异硫氰酸荧光(yíngguāng)素Phycoerythrin(PE)藻红素Allophycocyanin(APC)异藻蓝蛋白Peridinin-ChlorophyllProtein(PerCP)多甲藻黄素-叶绿素蛋白TandemDyesPE-TexasRed(ECD)PE-Cy5(PC5)PE-Cy5.5(PC5.5)(futures)PE-Cy7(PC7)(futures)第三十二页，共79页。FACSCantoⅡ信号检测(jiǎncè)组件种类(zhǒnglèi)八角形三角形构成检测器滤片第三十三页，共79页。FACSCantoⅡ信号(xìnhào)检测组件八角形检测(jiǎncè)组件第三十四页，共79页。FACSCantoⅡ信号(xìnhào)检测组件三角形检测(jiǎncè)组件第三十五页，共79页。FACSCantoⅡ信号(xìnhào)检测组件检测器鞘液流中的颗粒(kēlì)通过激光束时会产生光信号，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理。FACSCanto两类检测器光电二极管：FSC光电倍增管PMT：SSC和荧光信号第三十六页，共79页。FACSCantoⅡ信号(xìnhào)检测组件光学滤片用于调整(tiáozhěng)光谱的分布。当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。第三十七页，共79页。FACSCantoⅡ的滤片长通滤片（LP）：长于设定波长(bōcháng)的光通过，并反射短于设定波长(bōcháng)的光第三十八页，共79页。FACSCantoⅡ的滤片带通滤片：允许(yǔnxǔ)一定带宽波长的光通过。第三十九页，共79页。FACSCantoⅡ的滤片第四十页，共79页。FACSCantoⅡ的滤片第四十一页，共79页。FACSCantoⅡ电子系统将与电脉冲信号强弱相关的电压数字化有三类电脉冲信号高度信号H面积(miànjī)信号A宽度信号W第四十二页，共79页。几个(jǐɡè)概念信号放大PMT将光信号转换成电信号，调整(tiáozhěng)PMT的电压，信号强度将随之改变。阈值信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。第四十三页，共79页。几个(jǐɡè)概念颜色补偿采用合适(héshì)的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。第四十四页，共79页。颜色(yánsè)补偿FITC主要由FITC的检测器检测，但部分(bùfen)光也会进入PE检测器第四十五页，共79页。几个(jǐɡè)概念颜色补偿带通滤片接受的是一定带宽波长(bōcháng)的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。第四十六页，共79页。几个(jǐɡè)概念颜色补偿(bǔcháng)通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%第四十七页，共79页。补偿(bǔcháng)模型图第四十八页，共79页。颜色补偿(bǔcháng)判断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 未作颜色(yánsè)补偿第四十九页，共79页。颜色补偿判断(pànduàn)标准补偿(bǔcháng)后第五十页，共79页。怎样(zěnyàng)进行颜色补偿CompBeads用于流式细胞仪多色分析时调整荧光补偿。含两种微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白链的微球，可与小鼠/大鼠免疫球蛋白的链结合(jiéhé)；及阴性对照微球，不与免疫球蛋白结合(jiéhé)。这两种微球与鼠源性的荧光抗体混合时，显示为清晰的阳性群与阴性群（背景荧光），可据此手动调整颜色补偿。Anti-MouseIg补偿微球组合，产品号：552843Anti-RatIg补偿微球组合，产品号：552844Anti-Rat/hamsterIg补偿微球组合，产品号：552845第五十一页，共79页。仪器(yíqì)运作需要的质控品仪器校准(jiàozhǔn)需要微球BDFACS7-ColorSetupBeads（CatNo.335775）补偿调整需要微球BDCompBeadsAnti-MouseIg,(CatNo.552843)BDCompBeadsAnti-RatIg,(CatNo.552844)仪器清洁BDFACSRinse漂白水第五十二页，共79页。流式细胞仪的应用(yìngyòng)第五十三页，共79页。流式细胞仪可以(kěyǐ)告诉我们什么？第五十四页，共79页。细胞内和细胞外发生(fāshēng)了什么事件？第五十五页，共79页。流式细胞术的应用(yìngyòng)细胞生理学研究细胞膜表面标记胞内标记细胞周期分析(fēnxī)凋亡分析(fēnxī)分选CBA第五十六页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究细胞相对大小和颗粒性胞内pH值检测Ca++流动性检测膜电势(diànshì)检测细胞活性检测细胞活力(增殖能力)的检测第五十七页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究细胞相对大小和颗粒(kēlì)性分析第五十八页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究胞内pH值的检测(jiǎncè)第五十九页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究Ca2+流动性检测Ca2+是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生(fāshēng)改变。最常用的染料Indo-1excitedatUVFluo-3excitedat488nmFuraredexcitedat488nm第六十页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究Ca2+流动性检测(jiǎncè)第六十一页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究细胞膜电位的改变超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大(zēnɡdà)；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。染料和试剂DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)ValinomycinGramicidinDCCCP第六十二页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究细胞膜电位(diànwèi)的改变第六十三页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究细胞(xìbāo)活性分析第六十四页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究细胞活力分析CFSE(CarboxyfluoresceinSuccinimidylester)是一种亲脂性染料，可被细胞膜吸收。细胞标记CFSE后再诱导增殖，分裂后的细胞将含半量的CFSE，如此可监控(jiānkònɡ)细胞分裂的数目。第六十五页，共79页。细胞(xìbāo)生理学研究细胞活力分析(fēnxī)上图中人T细胞被标记并刺激后，可跟踪六代的分裂。如果配合使用Modfit软件分析(fēnxī)，可确定每代的细胞数。第六十六页，共79页。细胞膜表面(biǎomiàn)标记CD2CD4CD#=clusterdesignationnumber第六十七页，共79页。细胞(xìbāo)内标记胞内多种肽类已被成功标记(biāojì)，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase.胞内细胞因子磷酸化蛋白第六十八页，共79页。细胞(xìbāo)内标记胞内细胞因子第六十九页，共79页。细胞(xìbāo)内标记磷酸化蛋白接受刺激后细胞的动态反应刺激因子对特异位点的作用检测转录后调控特殊蛋白在正常(zhèngcháng)及异常细胞的表达第七十页，共79页。细胞(xìbāo)内标记磷酸化蛋白(dànbái)RelativeCellNumberAlexaFluor®488ControlIFN-gstimulated(1000 u/ml)第七十一页，共79页。细胞周期分析(fēnxī)DNA含量(hánliàng)分析-PI染色第七十二页，共79页。细胞周期分析(fēnxī)DNA含量(hánliàng)分析第七十三页，共79页。细胞(xìbāo)凋亡细胞膜分析-PS外翻PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白(dànbái)Annexin-V可与PS结合第七十四页，共79页。CBA（CytometricBeadArray）++AnalyteofInterestFluorescentDetectorAbCaptureBeadCaptureAb第七十五页，共79页。CBA第七十六页，共79页。BD网站(wǎnɡzhàn)更多的产品信息(xìnxī)请登陆bdbiosciences第七十七页，共79页。谢谢(xièxie)大家第七十八页，共79页。内容(nèiróng)总结BD公司介绍。FACSVantageSE-大型分选机。(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液。两根激光(jīguāng):488nm、633nm、。低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。这些短暂的光信号被收集、过滤然后被检测器转换成电信号。PE-TexasRed(ECD)。FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入PE检测器。IFN-gstimulated(1000 u/ml)。谢谢大家第七十九页，共79页。