增加摄入欧米伽3脂肪酸可减少病理性视网膜血管形成

?医学》：增加摄入欧米伽3脂肪酸可减少病理性视网膜血管形成来源：《自然?医学》2007.7KipMConnor1，9，JohnPaulSanGiovanni2，9，ChatarinaLofqvist1，3，ChristopherMAderman1，JingChen1，AkikoHiguchi1，SongHong4，ElkeAPravda1，SharonMajchrzak5，DeborahCarper6，AnnHellstrom7，JingXKang8，EmilyYChew2，NormanSalemJr5，CharlesNSerhan4&LoisEHSmith1哈佛大学医学院波士顿儿童医院眼科，波士顿，麻萨诸塞州，美国美国国立眼科研究所流行病学临床研究中心，马里兰，美国瑞典GcTteborg大学Sahlgrenska学院儿科，瑞典波士顿，麻哈佛医学院手术与疼痛医学中心麻醉科，实验性治疗与再灌注损伤研究中心，波士顿，麻萨诸塞州，美国5膜生物化学与物理学实验室，美国国家酒精滥用与酒精重度研究中心，马里兰，美国国立眼科研究所主任办公室，马里兰，美国Geo''teborg大学Sahlgrenska学院临床神经内科，瑞典哈佛大学医学院麻萨诸塞州总医院药剂科，波士顿，美国很多影响视力的疾病具有两面性，即它既有血管的损害，同时也有伴随的缺氧引起的具有破坏性的新生血管形成。包括早产儿视网膜病和糖尿病性视网膜病，这些疾病导致了美国超过4百万中年人及儿童失明。我们研究了欧米伽－3和欧米伽－6多不饱和脂肪酸（PUFAs）对氧诱导视网膜病小鼠模型的血管损害及损坏后血管再生，及缺氧导致的病理性新生血管形成的影响1。我们发现通过饮食或遗传方法增加组织中欧米伽－3多不饱和脂肪酸水平可增加损伤后血管生成而缩小视网膜无血管区，从而减少低氧对新生血管形成的刺激。具有生物活性的欧米伽－3多不饱和脂肪酸衍生的调节介质：神经保护素D1，resolvinD1及resolvinE1，可能抑制了新生血管形成。欧米伽－3多不饱和脂肪酸的潜在影响作用及它们的生活活性代谢产物部分是通过抑制肿瘤坏死因子TNF-a而产生的。在视网膜血管附近小胶质细胞亚组中发现了这些炎症细胞因子。这些发现提示增加欧米伽－3多不饱和脂肪酸或它们的生物活性产物能减少病理性新生血管形成。西方人的饮食中经常缺乏欧米伽－3多不饱和脂肪酸，早产儿通常缺乏在妊娠末三个月由母体转移给婴儿的欧米伽－3多不饱和脂肪酸2。食物中补充欧米伽－3多不饱和脂肪酸可能有利于预防视网膜病变。表1生后17天小鼠视网膜脂肪酰基组成（%）w－6diettypeWildw－3dietFat-1脂肪酸（n=6）（n=6）（n=4)饱和脂肪酸PA（16:0）22.53（0.14）22.81（0.24）21.40（0.05）21.830.88）SA（18:0）20.30（0.12）20.51（0.26）19.010.06）19.260.14）TotalSFA44.85（0.21）45.39（0.43）41.840.43）42.311.14）多不饱和脂肪酸W－A(18:1w－9)8.430.03）8.79a0.09）6.610.13）6.910.62）VA（18:1w－7）2.400.03）2.21a0.04）2.010.05）1.820.13）TotalMUFA11.980.10）12.150.12）9.450.21）9.610.99）w－6多不饱和脂肪酸LA（18:2w－6）0.740.01）AA（20:4w－6）8.87a0.34）0.90（0.04）a7.11（0.35）a1.6511.400.04）0.21）1.768.410.09）0.00）DTA（22:4w－6）a1.25（0.150.57（0.09）a2.250.03）0.850.05）DPA（22:5w－6）4.29（0.29）0.96（0.08）a4.93（0.12）0.290.01）Totalw-6-PUFA15.82（0.39）10.50（0.30）a21.66（0.28）12.690.10）w－3多不饱和脂肪酸ALA（18:3w－3）a0.03（0.003）0.03（0.01）0.01（0.00）0.030.01）EPA（20:5w－3）0.020.0002）0.25（0.02）a0.00（0.00）0.520.01）DPA（22:5w－3）a0.170.01）a0.47（0.03）0.15（0.01）0.760.01）DHA（22:6w－3）a12.650.93）17.92（1.07）a17.58（0.22）26.580.39）Totalw-3-PUFA12.87（0.93）18.68（1.07）a17.74（0.22）27.930.37）DHA/DPAw－63.08（0.40）（5.14）aw－6/w－3比率1.2319.63（2.32）a3.57（0.13）92.360.561.220.45视网膜脂质，按占总脂肪酸量的百分比计算， 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差在圆括号内表示，比较了喂养欧米伽－3多不饱和脂肪酸或欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食或喂养欧米伽－6多不饱和脂肪酸的fat-1基因或野生株对照组。PA,软脂酸；SA,硬脂酸；SFA,饱和脂肪酸；OA油酸；VA,vaccenicacid;MUFA多不饱和脂肪酸；LA,亚油酸；AA二十碳四烯酸；DTA二十二碳四烯酸；ALA,a—亚油酸；EPA二十碳五烯酸；DHA,,二十二碳六烯酸；欧米伽—3多不饱和脂肪酸或欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食或喂养欧米伽－6多不饱和脂肪酸的fat-1基因或野生株对照组数据差别明显(P&0.005)。视网膜新生血管形成是所有年龄组人群失明的最常见原因：包括早产儿视网膜病，成人糖尿病性视网膜病，老年人群中与年龄相关的黄斑退行性改变。大体而言，眼睛中破坏性的血管发生可通过直接抑制新生血管形成或通过控制血管损害降低低氧刺激的新生血管形成而得到改善。我们制作了氧诱导的血管损害的小鼠视网膜病模型，用来判定视网膜血管损害，损害后血管再生及病理性血管发生1。很早就确定了脂质在血管发生中的作用3，4。视网膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA主要是二十二碳六烯酸(DHA;C22:6n-3)和二十碳四烯酸(C20:4n-6),这两种脂肪酸最初都是在神经和血管细胞膜磷脂内发现的5。二十碳五烯酸(EPA;C20:5n-3)被发现存在于视网膜血管内皮细胞内6。食物来源的欧米伽－3多不饱和脂肪酸和欧米伽－6多不饱和脂肪酸，及由磷脂酶A2释放的游离脂肪酸组成了底物。这些脂肪酸然后被转变为具有生物活性的代谢产物，如：二十碳四烯酸转变为类花生酸类物质，二十二碳六烯酸转变为神经保护素，及由二十二碳六烯酸转变的D族resolvin，及由二十碳五烯酸转变的E族resolvin8，9。对脂质介质3，6的认识及关于多不饱和脂肪酸和新生血管性年龄相关的黄斑退行性改变的流行病学数据，提示二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸及二十碳四烯酸在活体实验中能调节视网膜血管闭塞及新生血管形成3。因此，我们测试了适当的摄入欧米伽－3多不饱和脂肪酸或欧米伽－6多不饱和脂肪酸是否能改变视网膜血管发生。我们同时也利用遗传模型测试了多不饱和脂肪酸的作用，这个转基因小鼠模型过度C.elegansfat-1基因，并将欧米伽－6多不饱和脂肪酸转变为欧米伽－3多不饱和脂肪酸，以提高组织中欧米伽－3多不饱和脂肪酸的浓度水平10。图1:提高欧米伽-3多不饱和脂肪酸浓度水平可使小鼠血管闭塞和视网膜新生血管形成减少。喂养欧米伽-3多不饱和脂肪酸或欧米伽-6多不饱和脂肪酸饮食的小鼠氧诱导视网膜病后行视网膜组织包埋显微镜检查。（a）对生后17天的喂养欧米伽-6多不饱和脂肪酸和欧米伽-3多不饱和脂肪酸饮食小鼠的视网膜血管进行异凝集素B4-异硫鼠酸荧光素染色以显示血管闭塞和新生血管形成（w-6,n=14,w-3,n=27）（scalebar,1mm。欧米伽-3多不饱和脂肪酸和欧米伽-6多不饱和脂肪酸饮食小鼠生后17天（b）血管闭塞及（c）新生血管形成。（d）生后17天野生株（WT与Fat-1小鼠视网膜血管闭塞和新生血管形成（scalebar,1mm）。fat-1小鼠与对照组（野生株，n=20;Fat-1,n=16）相比（e）血管闭塞及（f）新生血管形成。（g,h）喂养欧米伽—6多不饱和脂肪酸或欧米伽—3多不饱和脂肪酸小鼠生后第7到12天暴露于75%S气后，即生后12天，13天,15天，17天小鼠视网膜包埋组织中血管形成区域所占百分比。（g）Fat-1小鼠或它们的对照组（h）,每组n=8-20,PW0.001,PW0.0001,NS,不明显。为了研究氧诱导的视网膜病，我们给分别实验小鼠喂养日本或西方的完全等热量的食物，食物中含有2%的欧米伽-3多不饱和脂肪酸（二十二碳六烯酸及二十碳五烯酸）或欧米伽—6多不饱和脂肪酸（二十碳四烯酸）（网上补充表1）。我们同时检测了Fat-1转基因小鼠食用欧米伽一6多不饱和脂肪酸后视网膜病的情况（网上补充表2）。911母乳中脂质含量反应了母亲饮食中脂质的情况‘。我们发现小鼠视网膜脂质组成反应了小鼠（及小鼠母亲）饮食中摄入脂质的情况。通过欧米伽-3多不饱和脂肪酸饮食或fat-1基因的表达（PW0.005）,生后母乳喂养的小鼠生后17天的视网膜中所有形式的欧米伽一3多不饱和脂肪酸（包括二十碳五烯酸（EPA及二十二碳五烯醇（DPA-w-3,及二十二碳六烯酸（DHA）浓度水平均有提高。喂养欧米伽-3多不饱和脂肪酸组与欧米伽-6多不饱和脂肪酸组相比，视网膜中欧米伽-6多不饱和脂肪酸（二十碳四烯酸，二十二碳四烯酸（DTA）及二十二碳五烯醇（DPA-w-6）含量较低，并且Fat-1转基因小鼠也比野生株小鼠含量低（PW0.005）。通过饮食增加欧米伽—3多不饱和脂肪酸或通过fat-1基因表达均可导致总欧米伽—6/欧米伽—3多不饱和脂肪酸比率下降大于50%（表1）。我们发现视网膜中低欧米伽一6/欧米伽一3多不饱和脂肪酸比率可以预防病理性新生血管形成。生后17天的小鼠与小鼠欧米伽-6多不饱和脂肪酸饮食组与欧米伽-3多不饱和脂肪酸饮食组视网膜血管闭塞区/视网膜总面积分别为21.5±0.4%与13.7±0.5%,PW0.0001（图1a,b）。然而，欧米伽—3多不饱和脂肪酸饮食的生后17天的小鼠与欧米伽-6多不饱和脂肪酸饮食的生后17的小鼠相比可明显避免病理性新生血管形成，5.7土0.4%与9.0±0.6%PW0.0001（图1a,c）。■F阍箕■Jo田nn图2：欧米伽—3多不饱和脂肪酸衍生产物resolvinD1（RvD1）,RvE1或神经保护素D1（NPD）通过减少血管闭塞和新生血管形成而预防视网膜病。（a）欧米伽-3多不饱和脂肪酸（二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸）代谢产物生物合成途径。w-22-羟基—PD1是NPD1的生物活性产物。RvE2是E族二十碳五烯酸resolvins的生物活性产物。（b,c）RvE2的液体层析MS-MS光谱（b）及欧米伽—3多不饱和脂肪酸饮食小鼠视网膜提取物o-22-羟基-PD1（c）。（d）resolvinD1（RvD1）,RvE1或神经保护素D1（NPDj处理小鼠与对照组相比生后17天血管闭塞情况。（e）生后5到8天腹腔内注射RvD1（n=14）,RvE1（n=10）orNPD1（n=14）的小鼠与对照组（n=14）相比生后17天新生血管形成情况。（f）由RvD1（n=7）,RvE1（n=9）,NPD1（n=7）或saline（n=6）处理后的生后第8天小鼠血管闭塞情况。（g）左列，生后14天的喂养欧米伽一6多不饱和脂肪酸的氧诱导视网膜病小鼠的视网膜包埋体内皮细胞染色（红色）。阳性集落刺激因子—1Csf1r（绿色）及ChemR23（红紫色），中间聚焦，收集图像（scalebar,50微米）；白色表明三种染色的混合。右列，阳性集落刺激因子一1Csf1r+细胞的4张图像提示焦平面（z=1.1微米，2.1微米，3.0微米和4.0微米）。横断面红线表明Z与左列相关的相对深度#P<0.05;**Pw0.0001。我们证实Fat-1转基因小鼠10能增加视网膜欧米伽－3多不饱和脂肪酸水平而抑制新生血管形成（表1）。生后17天氧诱导视网膜病后，野生株小鼠由于缺乏fat-1转基因有范围更大的血管闭塞区/视网膜总面积（21.9±0.7%与11.9±0.5%）（PW0.001）（图1d，e），但野生株比Fat-1小鼠视网膜包埋体内有更严重的视网膜新生血管形成（8.3±0.8%与4.3±0.7%）（图1d,f）,因为Fat-1纯合子小鼠欧米伽一6/欧米伽一3多不饱和脂肪酸比率比前者降低（表1）。欧米伽－3多不饱和脂肪酸能保护生后17天小鼠不患视网膜病是由于增加了血管再生及并不减少组织内氧过多时氧诱导的血管损害。不同实验小组暴露于75%氧气中24小时后并没有观察到血管损害有任何差别。暴露于75%氧气中5天后，喂养欧米伽－3多不饱和脂肪酸或欧米伽－6多不饱和脂肪酸的生后12天小鼠，Fat-1转基因小鼠或对照组，没有观察到血管闭塞有明显不同（图1g,h）。然而，从生后12天至13天开始喂养欧米伽一3多不饱和脂肪酸的小鼠比喂养欧米伽－6多不饱和脂肪酸的小鼠视网膜无血管区范围小。这种减少一直维持到生后17天（图1g）。在Fat-1转基因小鼠和对照组中同样观察到了相似的变化（图1h）。Resolvins（溶解相相互作用产物）与神经保护素是欧米伽－3多不饱和脂肪酸生物活性代谢产物，分别是由二十碳五烯酸（EPA和二十二碳六烯酸（DHA衍生而来（图2a）。它们首先在分析富含二十二碳六烯酸组织时被发现12。它们参与调节血管发生的作用还没有被研究清楚12。在欧米伽-6多不饱和脂肪酸饮食小鼠视网膜中利用串联质谱分析（MS-MS脂质层吸仪没有发现resolvins和神经保护素。然而，在欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食小鼠视网膜中，我们发现了w-22-羟基-保护素D1（PD1）和resolvinE2（RvE2）,这两种物质分别是神经保护素D1（NPD）和resolvinE1（RvE1）的标志物（图2b,c,网上补充表3）13'14。没有补充欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食的小鼠腹膜内的resolvinD1（RvD1），RvE1或神经保护素D1（NPD1）浓度水平非常低（10纳克/天，补充欧米伽－3多不饱和脂肪酸的小鼠视网膜发现的剂量，补充表3），与对照组相比明显能够避免生后17天小鼠血管闭塞（P<0.0001）（图2d）和新生血管形成P<0.03）（图2e）。我们没有观察到生后6天的喂养欧米伽－3多不饱和脂肪酸和欧米伽－6多不饱和脂肪酸小鼠之间血管生成有任何区别，补充resolvinD1（RvD1），RvE1或神经保护素D1（NPDD的小鼠（生后4至IJ5天）与对照组之间有明显差别（网上补充图1）。生后5到8天的喂养resolvinD1（RvDD,RvE1或神经保护素D1（NPD）的小鼠与对照组相比，我们也没有观察到血管损害有明显差别（图2f）。生后17天时，所有治疗组与对照组相比血管闭塞明显较少（图2d），这提示这些化合物能通过增加血管再生而不是通过预防血管损害而产生预防视网膜病的作用。这些发现于我们喂养多不饱和脂肪酸的实验结果相同，提示欧米伽－3多不饱和脂肪酸预防视网膜新生血管形成的保护性作用部分是由具有生物活性的resokinDI（RvDD,RvE1或神经保护素D1（NPDj等物质介导的。我们接着研究了resolvinDI（RvD1）,RvE1或神经保护素D1（NPDD等物质介导欧米伽－3多不饱和脂肪酸预防视网膜新生血管形成作用的机制。RvE1结合到受体ChemR23上时能阻断促炎症反应细胞因子的产生15'16。我们在视网膜包埋体内定位了ChemR2隹邨日性集落刺激因子－1（Csf1r+）亚组小胶质细胞，这些细胞在形态上有别于固有的小胶质细胞。这些细胞与视网膜血管紧密联系（图2g）。我们没有在视网膜别处发现ChemR23这些发现与欧米伽－3多不饱和脂肪酸衍生的生物活性介质与小胶质细胞上的受体相互作用以减少促炎症反应细胞因子的产生的观点相同。我们随后检测了促炎症反应细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-a。在其他系统，调节肿瘤坏死因子的产生可通过调节上皮细胞分裂周期影响血管生成17，18。此外，缺乏肿瘤坏死因子（TNF）-a的小鼠氧诱导视网膜病发生较少19。因此，我们假设欧米伽－3多不饱和脂肪酸和欧米伽－6多不饱和脂肪酸及它们的生物活性代谢产物部分是通过调节肿瘤坏死因子（TNF）-a的表达而产生作用的。与我们假设一直的是，我们发现欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食能抑制视网膜肿瘤坏死因子信使核糖核酸（TnfmRNA）的表达，这种信使编码肿瘤坏死因子（TNF）-a,与欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食小鼠相比氧过多（生后8天）及缺氧时（生后14天）表达约90%（P<0.0001）（图3a）。与欧米伽—6多不饱和脂肪酸饮食组相比，欧米伽—3多不饱和脂肪酸饮食组视网膜肿瘤坏死因子（TNF）-a蛋白水平受抑下降30%（PW0.001）（图3a）。与观察到的欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食组相同，对欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食组小鼠腹腔内注射分离肿瘤坏死因子（TNF）-a的（TNF）-a受体融合蛋白（依那西普），生后17天小鼠视网膜无血管区减少（P&0.001）（图3b）,病理性新生血管形成也减少（PW0.05）（图3c）。伴有受抑而不是消除的肿瘤坏死因子（TNF）-a（图3b）的欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食小鼠进行腹腔注射治疗后还将进一步减少血管闭塞（PW0.001）及新生血管形成（P<0.02）（图3b,c）。在眼球内注射依那西普也观察到了相同等结果（网上补充图2）。这些数据指明欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食组肿瘤坏死因子（TNF）-a浓度水平的部分降低似乎明显间接的促进了预防视网膜病的保护性作用。完全消除肿瘤坏死因子（TNF）-a与依那西普部分抑制肿瘤坏死因子（TNF）-a相比，减少视网膜新生血管形成和血管损害的作用更为明显。与期望相同的是，喂养欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食的Tnf+/+野生株小鼠与喂养欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食的小鼠相比，能减少血管闭塞和新生血管形成而保护视网膜（PW0.00001）（图3d,e）。然而，两组饮食的生后17天的Tnf-/-小鼠有更明显但不平均的血管闭塞和新生血管形成减少。在完全消除肿瘤坏死因子（TNF）-a的情况下，没有发现欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食小鼠具有预防视网膜病的作用（减少血管闭塞或新生血管形成），也没有发现欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食小鼠视网膜病发病率增加（图3d，e），这提示肿瘤坏死因子（TNF）-a在视网膜病疾病进程中有很重要的作用。我们随后寻找了视网膜中肿瘤坏死因子（TNF）-a的细胞来源。尽管多种细胞可以产生肿瘤坏死因子（TNF）-a，但单核细胞－衍生细胞产生的肿瘤坏死因子（TNF）-a是主要来源20。小胶质细胞，巨噬细胞及树状突细胞是影响视网膜脉管系统发展和修复的阳性集落刺2122激因子－1（Csf1r+）炎症细胞21，22。为了确定视网膜病中是这些细胞还是上皮细胞产生了肿瘤坏死因子（TNF）-a，我们在欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食的小鼠视网膜包埋体内利用共聚焦显微镜对肿瘤坏死因子（TNF）-a，阳性集落刺激因子－1（Csf1r+）和血管上皮细胞进行了免疫组织化学的标记和定位（图3f）。我们仅仅发现阳性集落刺激因子－1（Csf1r+）亚组细胞产生的肿瘤坏死因子（TNF）-a与视网膜脉管系统有关。这暗示了在这样的实验条件下，肿瘤坏死因子（TNF）-a主要是来源于与血管接近的阳性集落刺激因子－1（Csf1r+）亚组巨噬细胞或小胶质细胞。单核细胞或巨噬细胞对肿瘤坏死因子Tnf基因表达的诱导主要是依靠上游启动子区，包括NF-kB脱氧核糖核酸DNA吉合基序23。禾1J用NF-kB-荧光素酶（NF-kB-Luc）探针标记的小鼠24，我们发现欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食小鼠比欧米伽－3多不饱和脂肪酸饮食小鼠视网膜中NF-kB活性增加了约100%（PW0.00001）（图3g）。在视网膜包埋体内，我们发现与视网膜脉管系统相关的小胶质细胞亚组具有NF-kB转录活性（图3h）,与ChemR23（图2g）及TNF-a（图3f）相似。这些结果提示视网膜巨噬细胞或小胶质细胞亚组可能涉及视网膜血管发生，通过调节NF-kB诱导的肿瘤坏死因子（TNF）-a的产生部分的发挥作用。二十二碳六烯酸（DHA和二十碳五烯酸（EPA）作用于培养基中阳性集落刺激因子—1（Csf1r+）小胶质细胞或巨噬细胞能抑制肿瘤坏死因子信使RNA（TnfmRNA的产生（网上补充图3）。此外，resolvinD1（RvDD,RvE1或神经保护素D1（NPDD的代谢产物剂量依赖性地降低培养基中及其它炎症模型中的巨噬细胞的肿瘤坏死因子信使RN(ATnfmRN)A的表达15,25-27。总之，欧米伽－3及欧米伽－6多不饱和脂肪酸能显著影响视网膜血管生长和病理变化。二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸及生理浓度水平的生物活性产物（resolvinD1（RvD1），RvE1或神经保护素D1（NPD））能通过增强血管损害后再生而减少病理性新生血管形成。巨噬细胞或小胶质细胞是视网膜血管生长和修复的关键成分21，22。增加饮食摄入欧米伽－6多不饱和脂肪酸（二十碳四烯酸）能增加视网膜小胶质细胞产生活性的肿瘤坏死因子（TNF）-a，而增加欧米伽—3多不饱和脂肪酸饮食（二十碳五烯酸EPA二十二碳六烯酸DHA却抑制肿瘤坏死因子（TNF）-a的产生。这些血管发生方面的作用可能对视网膜病及其它血管损害疾病的病理变化很重要。欧米伽一3多不饱和脂肪酸的对小鼠视网膜病的抑制作用与血管内皮生长因子（VEGF抑制因子28治疗的作用相当，并且前者可能有另外的抗血管内皮生长因子作用，因为欧米伽一3多不饱和脂肪酸饮食小鼠血管内皮生长因子（VEGF没有受到明显抑制（未提供数据）。这些结果表明增加欧米伽-3多不饱和脂肪酸饮食可能是预防增生性视网膜病一种有效的治疗方法。resolvinDI（RvD1）,RvE1或神经保护素D1（NPD1是有效的抗炎和调节介质前体29。根据我们的知识，最近发表的研究结果提示最近发现的调节介质也是有效的血管发生调节因子。如果补充二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸或它们的生物活性介质产物能与当今研究的小鼠实验一样能改善人体视网膜血管病变，则这些干涉研究可能使百万人受益oLL也titEUr-ios-x丁:L・上苍士M:j胃吊■WMpnrr!ti印制?串ukJE'mnuuoftO9U与餐禅A£1wrJSTTr图3:视网膜病中多不饱和脂肪酸对肿瘤坏死因子（TNF）-a的调节。（a）左列，喂养欧米伽-6多不饱和脂肪酸和欧米伽-3多不饱和脂肪酸小鼠（n=6）平均视网膜肿瘤坏死因子信使RNA（TnfmRNA表达。右列，生后14天的喂养欧米伽一6多不饱和脂肪酸和欧米伽一3多不饱和脂肪酸小鼠（n=4）的标准化的视网膜肿瘤坏死因子（TNF）-a蛋白水平。（b,c）使用依那西普抑制肿瘤坏死因子（TNF）-a减少欧米伽—6多不饱和脂肪酸诱导的视网膜病。（b）生后17天小鼠依那西普治疗组与对照组血管闭塞情况，喂养欧米伽—6多不饱和脂肪酸组（n=8）及喂养欧米伽—3多不饱和脂肪酸组（n=10）。（c）生后17天的喂养欧米伽－6多不饱和脂肪酸小鼠依那西普治疗后与喂养欧米伽－3多不饱和脂肪酸组（n=10）对照组（（n=8）相比新生血管形成情况。（d）生后17天欧米伽—3多不饱和脂肪酸组（n=15与n=11）Tnf+/+和Tnf-/-小鼠或欧米伽一6多不饱和脂肪酸组（n=22andn=10）血管闭塞情况。（e）生后17天欧米伽—3多不饱和脂肪酸组（n=15与n=11）Tnf+/+和Tnf7-小鼠或欧米伽—6多不饱和脂肪酸组（n=22andn=10）新生血管形成情况。（f）生后17天的喂养欧米伽—6多不饱和脂肪酸的氧诱导视网膜病小鼠的视网膜包埋体内皮细胞染色（红色），阳性集落刺激因子－1Csf1r（绿色）及ChemR23（红紫色）。中间聚焦，收集图像（scalebar，50微米）。右列，阳性集落刺激因子—1Csf1r+细胞焦平面（z=1.1微米，1.9微米，2.8微米和3.6微米）。横断面红线表明Z与左列相关的相对深度。（g）喂养欧米伽－6多不饱和脂肪酸（n=10）及欧米伽—3多不饱和脂肪酸（n=11）NF-kB—荧光素酶探针标记的小鼠身后14天氧诱导视网膜病NF-kB（荧光素酶）活性（相对冷光单位）。（h）左列，生后14天的喂养欧米伽－6多不饱和脂肪酸的氧诱导视网膜病小鼠的视网膜包埋体内皮细胞染色（红色），CD11b（绿色）及荧光素酶（红紫色），右侧聚焦，收集图像，Scalebar，20微米；#P<0.05,**P&0.001,***pw0.0001。方法小鼠：这些研究遵循视觉与眼科学研究协会关于视觉与眼科学研究动物使用声明，并得到了儿童医院动物保健与使用委员会的许可。在这些饮食研究中，我们喂养怀孕的C57BL/6母鼠啮齿目动物食物，即10%（w/w）的红花油，包括2M米伽—6多不饱和脂肪酸（二十碳四烯酸）而无欧米伽—3多不饱和脂肪酸（二十碳五烯酸EPA二十二碳六烯酸DHA,或者是2%的欧米伽－3多不饱和脂肪酸而无欧米伽－6多不饱和脂肪酸（补充表1）。食物中脂质暴露于氧气中也相当稳定，因为这没有可见的脂质氧化，实验过程中没有脂质分解，一年没有冷藏也没有脂质分解（网上补充表4）。DSMt养产品公司生产的饮食用多不饱和脂肪酸商品名为ROPUFA补充的二十碳四烯酸和二十二碳六烯酸商品名分别为ARASCO口DHASCO都是由Martek生物科技公司生产。饲养过程由饮食研究中心执行。Fat-1转基因小鼠含有一人类化的fat-1反向转录脱氧核糖核酸（cDNA,由细胞巨化病毒增强子和鸡b－肌动蛋白启动子转录10。Fat-1和对照组都被喂养特定的欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食（补充表2）。TNF-a-缺乏株（Tnf-/-,JacksonLaboratoriesstockno.003008）和Tnf+/+野生株（stockno.101045）小鼠按照上述C57BL/6母鼠饮食喂养。使用pBIIX－荧光（素）酶在NF-kB－Luc探针标记的小鼠（stockno.006100）基因内靶向构造两个以24前描述过的NF-kB最小Fos启动子前的自免疫球蛋白轻链基因内DNA曾强子结合位点氧气－诱导视网膜病（血管退化，再生及病理性新生血管形成）为了诱导血管损害，生后7天的小鼠被暴露于75%的氧气中到生后12天1。在小鼠生后12天时我们评估了血管损害并在生后13天，15天，17天评估了血管再生。我们在小鼠生后17天评估了视网膜新生血管形成，也就是在回归空气环境5天以后，这时新生血管反应最为强烈。血管闭塞和视网膜新生血管形成的量化，见网上补充方法。Resolvins与神经保护素：我们对生后17天的小鼠分析了脂质介质概况，这些小鼠喂养的是欧米伽－3多不饱和脂肪酸或欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食并在生后第7到12天暴露于氧气环境下生长。我们利用重氢内部标记和MS-M刚节信息学程序提取，鉴定，量化了多不饱和脂肪酸衍生产物。我们得到了6条小鼠的研究结果。更多细节参见补充方法。脂质提取和脂肪酸分析：视网膜标本包括每块分析过的视网膜组织，而且结果以平均数的形式表示。我们利用6890号气相层析仪（AgilentTechnologies），使用稀释25倍的1毫升注射液进行了快速气相层析分析。更多细节参见补充方法。肿瘤坏死因子（TNF）-a（依那西普）处理：分别对生后7天，12天，14天及16天的喂养欧米伽－3多不饱和脂肪酸或欧米伽－6多不饱和脂肪酸的小鼠腹腔内注射可溶性肿瘤坏死因子（TNF-a受体（依那西普，500mg/每只老鼠）30。正如以前描述的一样，我们将生后17天时小鼠视网膜组织分离，固定，染色及包埋以评估血管闭塞和视网膜新生血管形成21。免疫组织化学：将饲养欧米伽－6多不饱和脂肪酸饮食的小鼠眼球挖出。然后浸泡于25度的4%多聚甲醛溶液中1小时，然后视网膜组织被分离，用1%聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100（T-8787,Sigma）透化处理，然后用异凝集素B4染色，如补充方法中描述的一样。我们在阳性集落刺激因子－1（Csf1r+）调控元件（JacksonLaboratoriesstockno.005070）的控制下表达绿色荧光蛋白的视网膜组织中见到了视网膜小胶质细胞。我们利用异硫氰酸荧光素标记的绿色荧光蛋白（F6005，Sigma）的第二抗体增强了荧光。我们依照建议对肿瘤坏死因子（TNF）-a抗体或ChemR23（sc-32652，SantaCruz）进行了共区域化研究。按照补充方法包埋了视网膜，并使用40X2倍LeicaSP2共焦显微镜进行了观察。间隔0.16mm,我们切取了光学切面，并在YZ平面内形成了一三维视图。参见补充方法。西式印迹法，参见补充方法基因表达定量分析（定量适时聚合酶链式反应PCR,参见补充方法NF-kB活性分析：NF-kB-Luc探针标记的母鼠生后被给予实验饮食并如前所述的使之患上氧诱导视网膜病。在生后14天时，我们从小鼠身上收集了视网膜组织，并使用GlowLysisBuffer（E2661,Promega）处理。我们使用欧米伽—3多不饱和脂肪酸（EPADHA和多种维生素制剂荧光素酶分析系统（E2610）分析了50mg视网膜组织匀浆的荧光素酶活性。在生后14天时我们包埋了视网膜组织，并含有对家兔荧光素酶及CD11b（Serotec，MCA74G）抗体（Abcam，ab21176）的荧光素酶蛋白进行了染色。数据分析：小鼠研究结果以平均数±s.e.m的形式表示，其它研究以平均数±s.d.表示。处理数据变量分析时a=0.05表示有意义。除非另外指明，我们都进行了实验后双样本假设检验。致谢感谢C.DiMartino，N.Liu，J.-R.Mo及K.Percarpio给予的技术支持，感谢J.-Y.Tsai参与讨论。感谢美国国立卫生研究院饮食补充办公室。本次研究得到了V.KannRasmussen基金和美国国立卫生研究院（EY008670，EY017017，EY14811（L.E.H.S.）;1F32EY017789，5T32EY07145（K.M.C.）;P50-DE016191，GM38765（C.N.S.）及波士顿儿童医院精神发育迟滞研究中心P01HD18655的大力支持。感谢青少年糖尿病研究基金（J.C.）.的友好支持。本次工作得到了L.E.H.S.防盲研究的支持。支持者没有参与研究设计，研究管理，也数据收集、分析和编译或准备，综述的撰写等等。