分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制

阐发人工髋枢纽置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制　　【摘要】目的探究人工髋枢纽假体分散出的颗粒碎片刺激巨噬细胞而开释的肿瘤坏死因子(TNF-α)在人工髋枢纽术后引起骨溶解的作用机理。要领接纳钛颗粒刺激巨噬细胞而开释TNF-α模子及酶联免疫吸附剂测定、卵白质印迹、凝胶迁徙率实行要领来研究其生物分子学机制。结果鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而开释TNF-α，而JNK按捺剂SP600125和NF-кB按捺剂G132大大按捺了钛颗粒诱导的TNF-α开释，但p38按捺剂无此作用，乃至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1和NF-кB。结论钛颗粒诱导的TNF-α开释与JNK/AP-1及NF-кB通路有关。　　【关键词】人工髋枢纽置换术钛颗粒骨溶解肿瘤坏死因子　　【Abstrat】bjetiveTstudytheehanisfstelysisafterttalhipreplaeentbyturnersisfatr-α(TNF-α)releaseinarphagesstiulatedithpartiulatedebrisfrprsthesis.ethdsAdelfTNF-αreleasebystiulatingarphagesithtitaniupartilesasadeandstudytheehanisfTNF-αreleasebyElisa/estblt/ESA.ResultsTNF-αasreleasedinurinearphagestiulatedbytitaniu(Ti)partilesandspeifiinhibitrsfJNK(SP600125)andNF-κB(G132),butntp38(SB203580)draatiallyinhibitedTi-stiulatedTNF-αrelease.rever,transriptinalativatinfAP-1andNF-κBasalsinduedbyTipartiles.nlusinTheseresultsdenstratethatTipartile-induedTNF-αreleaseisediatedthrughJNK/AP-1asellasNF-κBpathays.　　【Keyrds】THR;Tipartiles;stelysis;TNF　　人工髋枢纽置换术后假体四周的骨溶解及随后而来的假体疏松是置换术失败的常见缘故原由。由于假体长时间磨损与腐化天生的颗粒碎片导致假体四周形成假膜，这些假膜由肉芽肿形成，它包罗巨噬细胞、纤维母细胞、巨细胞及破骨细胞［1，2］。假体四周膜构造的这些细胞受这些碎片颗粒而产生有关骨溶解及假体松动的炎症因子如TNF-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-11及转化生长因子-β［3，4］。通过这些细胞因子的彼此作用，破骨细胞被激活汲取骨构造，导致骨溶解及假体松动。　　这些炎症因子中，TNF-α是很紧张的骨溶解因子。Kible等已证实TNF-α可以加强成骨细胞NF-кB配位子〔RANKLE〕受体及巨噬细胞-集落刺激因子(-SF)受体活性［5］。而且，Ingha等创造TNF-α又直接促进早破骨细胞分化并激活成熟的破骨细胞汲取骨构造［6］。与此同时,erkel等通已往除肿瘤坏死因子受体〔TNFR〕基因的动物颅骨与PA颗粒打仗，创造无骨溶解征象［7］。这些结果表现，TNF-α是人工枢纽术后磨损颗粒导致的骨溶解紧张细胞因子。但至今,尚未陈诉与此相干的分子生物学机制。本次实行,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而开释的TNF-α模子来阐发TNF-α合成的分子生物学机制。　　1质料与要领　　1.1质料DE造就基，牛胎血清〔FBS〕来自于GibInvitrgen公司〔Rkville.D〕。PD98059、SP600125、G132来自于albihe(LaJlaA)。抗磷酸-ERK/JNK/IkBα抗体来自于ellSignalingTehnlgy(Beverly,A)。测定鼠TNF-αELISA试剂盒来自于BiSureinternatinal(adisnI)。EGG来自于Siga(StLuis,)。硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于AershanBisienesrperatin(Pisataay,NJ)。别的化学试剂来自于Siga公司。　　1.3钛颗粒预备钛颗粒〔1～3μ〕来自于era(ilaukee,I)。颗粒用25％硝酸及95％乙醇、0.1N氢氧化钠混淆液消毒〔Ragabetal,1999〕。颗粒内毒素由LiulusAebyteLysate要领〔Bihittaker,alkersville,D〕测定。　　1.4要领　　2结果　　2.1钛颗粒刺激后由时间及剂量依靠性开释TNF-α为确定RA264.7细胞在何有用浓度的钛颗粒才气开释TNF-α，选择了三种差异浓度的钛颗粒并与RA264.7细胞混淆。取其上清液用ELISA法测定TNF-α。图1示三种浓度的钛颗粒剂量依靠性开释TNF-α，图2示0.02%浓度钛颗粒刺激后时间依靠性开释TNF-α。　　2.2ERK/p38/JNK/NF-кB按捺剂对RA264.7细胞受钛颗粒刺激而开释的TNF-α的结果为相识RA264.7细胞受钛颗粒刺激而开释TNF-α与哪支细胞信号通路有关，细胞先由ERK/p38/JNK/NF-кB按捺剂处置惩罚后，再受0.002%钛颗粒刺激24h。用ELISA法测定其上清液中的TNF-α。与比拟组〔651.5±9.3pg/l)比拟，30μPD98059,25μSB203580,20μSP600125,and10μG132各按捺TNF-α66%(218.2±21.1pg/l),20%(550±5pg/l),91%(56±6pg/l)and92%(51.3±4.7pg/l)(P0.01)(见图3)。此中JNK按捺剂〔SP600125〕及NF-кB按捺剂〔G132〕表现较强的按捺作用。图3ERK1/2、JNK及NF-кB按捺剂对RA264.7　　细胞受钛颗粒刺激而开释的TNF-α的结果2.3钛颗粒诱导的JNK/AP-1及NF-кB通道活化的结果为相识钛颗粒诱导的TNF-α开释的分子生物学机制，我们用磷酸化ERK/JNK特异性抗体检测了AP激酶。而且，测定IkB来相识NF-кB的活性。当钛颗粒刺激15in后，诱导磷酸化的ERK。磷酸化的JNK受刺激1h后达岑岭，随后落落。IkBa受刺激15in后落解而1h后最明显〔见图4〕。众所周知，活化的JNK可以-JUN磷酸化，继而活化AP-1转录因子［9］。为确定钛颗粒诱导的TNF-α开释与AP-1/NF-кB活化有无相干，RA264.7细胞受钛颗粒处置惩罚并ESA要领测定。由钛颗粒刺激15in及30in后，显着活化AP-1/NF-кB〔见图5〕。总之，这些结果表白钛颗粒诱导的TNF-α开释与调治落落与JNK/AP-1及NF-кB活性有关。　　3讨论　　人工枢纽术置换术后骨溶解及假体松动的发病机制由颗粒碎片激活巨噬细胞并开释TNF-α等炎症因子有关。低落这些炎症因子来制止假体四周炎症反响的巨噬细胞，从而可以防范骨溶解。TNF-α是免疫防范体系中重要的细胞因子，也是受颗粒刺激的巨噬细胞开释的紧张的介质［10，11］，因此，它的合成将成为制止颗粒诱导的骨溶解大概性目的。　　对受种种刺激而开释TNF-α已有许多研究。本研究中，证实白RA264.7巨噬细胞株受钛颗粒刺激后呈剂量实时间依靠性开释TNF-α〔见图1〕。在TNF-α启动因子中包罗AP-1/Ets/NFAT等差异的转录因子埋伏的结合位。这些转录因子对TNF-α基因活化起紧张作用［12］。此中，NF-кB是诱导TNF-α研究较多的转录因子之一［13，14］。而AP-1或其他转录因子大概与TNF-α表示有关［15］。现实上，RA264.7细胞受钛颗粒刺激后诱导JNK/ERK及IkB落解等信号分子活性〔见图4〕。与此结果相似，JNK及NF-кB药物性按捺剂相称程度上淘汰钛颗粒刺激而开释的TNF-α〔见图3〕。然而，我们以为JNK磷酸化Jun后活化AP-1是RA264.7细胞受钛颗粒刺激而活化的〔见图4〕。因此，我们试图是否RA264.7细胞受钛颗粒刺激后AP-1被激活。与我们预期一样，AP-1被钛颗粒敏捷激活,而且,同时激活NF-кB〔见图5〕。由此，我们可以必定RA354.7细胞受钛颗粒刺激产生TNF-α与JNK/AP-1及NF-кB通道有关。　　4结论　　此项研究初次证实白钛颗粒诱导的TNF-α开释不但与NF-кB通道有关,而且与JNK/AP-1通道有关。因此，我们以为制止这些通道将对人工髋枢纽置换术后产生的骨溶解及假体松动具有防范及治疗作用。