β1,4-半乳糖基转移酶I阻碍雪旺氏细胞增殖的机制

1，4－半乳糖基转移酶I阻碍雪旺氏细胞增殖的机制肖锋，季玉红，沈爱国严美娟刘海鸥孙琳琳【摘要】目的：探讨β1，4－半乳糖基转移酶I阻碍雪旺氏细胞增殖的机制。方式：将不同浓度的β-1,4-GalT-I 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达质粒转染雪旺氏细胞，采纳Westernblot方式检测增殖相关信号分子cyclinD一、p16INK4和p27Kip1的表达水平，Northernblot方式检测p19ARF的表达转变。结果：随着β-1,4-GalT-I在雪旺氏细胞中的表达增加，cyclinD1表达降低，而p16INK4a和p19ARF呈现相反的转变；p27Kip1转变不明显。结论：β-1,4-GalT-I阻碍雪旺氏细胞增殖可能与cyclinD一、p16INK4a和p19ARF介导的信号传导途径有关。【关键词】β1，4－半乳糖基转移酶I；雪旺氏细胞；增殖；大鼠雪旺氏细胞是周围神经系统的要紧胶质细胞，在周围神经的发育与再生进程中起重要作用。已有研究发觉转染β-1,4-GalT-I后引发雪旺氏细胞增殖抑制，而且致使细胞周期阻滞在G1/G0期[2]。本实验通过检测调剂细胞周期的相关信号分子，初步探讨β-1,4-GalT-I抑制雪旺氏细胞增殖的分子机制。实验试剂培育板、胰蛋白酶、胶原酶、胶原、多聚赖氨酸(上海华丽生物制品公司)；DMEM培育基(美国Gibco公司)；forskolin、阿糖胞苷、IgM型抗、兔补体（美国Sigma公司）；抗p16INK4a、抗p27、抗cyclinD1单克隆抗体（美国SantaCruzBiotechnology公司）；载体、LipofectawinTM2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；胶回收试剂盒（上海华舜公司）；PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）；试剂盒（美国Promega公司），表达质粒pcDNA—β由复旦大学上海医学院基因研究中心惠赠。方式-1,4-GalT-IPrime-a-gene1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方式材料实验动物新生1～2dSD大鼠60只，由南通大学动物中心提供。分离、纯化雪旺氏细胞无菌条件下掏出新生大鼠坐骨神经，用％胰蛋白酶/％胶原酶消化，先在含阿糖胞苷(Ara-C，5mmol／L)的培育液中培育48h，洗净Ara-C12h后，再进入含Ara-C培育液中培育24h，而后在正常培育液中培育。成纤维细胞通过补体介导的细胞毒作用而排除，方式为：IgM型抗(1∶200)作用30min，洗净抗体后，用兔补体(1∶200)作用30min。以后细胞进入含育液中，每2～3d改换培育液1次。Forskolin(2μmol／L)的培Westernblot在分离、纯化的雪旺氏细胞转染正义β-1,4-GalT-I表达质粒和pcDNA空载体（五、10、20、40μg/孔，6孔板）3天后收取细胞蛋白。改良Lowry法进行蛋白定量后，经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。转膜后，以5%TBST脱脂奶粉封锁液室温封锁2h，抗p16INK4a（1∶1000稀释），抗p27(1∶1000稀释），抗cyclinD1（1∶1000稀释）4℃孵育留宿。相应HRP偶联的二抗（1∶2000稀释）室温孵育2h。洗涤后以ECL发光底物显影，别离显示p16INK4a、p27、cyclinD1蛋白表达水平。GAPDH作为内参。p19ARF和β-1,4-GalT-IDNA 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 的制备p19ARF引物上游，5'-GTAATGCCACTGCTGGGAGA-3'；下游，5'-ATGTGGCTGCGGCCCTCT3'。--1,4-GalT-I引物：上游，5’-TTACTCECCAAGGACTGTG’；下-3游，5’-CTCTTGAAGCCGGATCATT’。-3Northernblot的探针标记依照试剂盒要求(Prime-a-gene)标记探针。Northernblot分析别离取β-1,4-GalT-I表达质粒和pcDNA载体不同转染浓度的雪旺氏细胞进行总RNA提取，40μgRNA上样，行甲醛变性胶电泳。转膜后，将膜用杂交液(含／LEDTA，1％BSA，7％SDS，15％甲酰胺)65℃预杂交4h，加入变性的标记探针，65℃杂交16h。洗膜、压片、-70℃放射自显影，5～7d后，洗片。2结果正常未转染和转染pcDNA空载体（五、40μg/孔）作为空白对照，将不同浓度的正义β-1,4-GalT-I表达质粒（五、10、20、40μg/孔），别离转染雪旺氏细胞，随质粒浓度的增加，雪旺氏细胞中β-1,4-GalT-ImRNA表达水平慢慢升高。当质粒浓度为5μg/孔时，cyclinD1蛋白质表达水平与正常无明显不同；随质粒浓度的升高，cyclinD1表达慢慢降低；p16INK4a蛋白质水平在质粒浓度为5μg/孔时即明显高于对照组，且质粒浓度增加时，仍维持同一高水平；p27Kip1转变不明显(图1)。p19ARFmRNA随着质粒浓度的升高，其表达水平慢慢升高，表现出必然的浓度依托关系(图2)。讨论正常细胞的增殖、静止和衰老的发生，离不开细胞因子对细胞周期的精准调控。细胞周期素（cyclin）和细胞周期素依托性蛋白激酶（cyclin-dependentkinase,CDK）是组成真核细胞调控细胞周期中心操纵体系中最为关键的两大基因家族。哺乳动物细胞从G1中期到后期的进程，依托于cyclinD1介导的CDK4或CDK6的激活。cyclinD1在许多肿瘤的发生中发挥重要的作用。cyclinD1参与激活的Ras和Myc介导的肿瘤细胞的增殖[3]。上皮细胞和成纤维细胞在H-Ras诱导衰老后，显现cyclinD1的表达水平下降，伴随有对生长因子的需求下降和细胞G1期的阻滞[4]。由于β-1,4-GalT-I过表达也能引发雪旺氏细胞增殖抑制，而且致使细胞周期阻滞在G1/G0期，因此咱们检测了cyclinD1表达水平，发觉随β-1,4-GalT-I在雪旺氏细胞中的表达增高，cyclinD1表达降低。CDK抑制分子（CDKinhibitors，CKIs）也是一类调剂细胞周期的重要分子，它们与细胞衰老有着紧密的关系。CKIs有两组家族：INK4家族和Cip/Kip家族。INK4家族由四个成员组成：p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c和p19INK4d。INK4家族的CKIs特异与CDK4-6结归并抑制其活性，从而阻碍CDKs使细胞周期割裂受阻。Cip/Kip是CKIs另外一个家族，它由三个成员组成：p21Cip一、p27Kip1和p57Kip2。已证明的与衰老发生相关的三条信号传导途径[5]p16INK4a/Rb、p19ARF/p53/p21Cip一、PTEN/p27Kip1，都与CKIs紧密相关。p16INK4a通过结合CDK4和CDK6，抑制它们磷酸化Rb，从而致使细胞G1期的阻滞。有研究说明，p16INK4a能够调剂β-1,4-GalT的表达和活性[6]；p19ARF通过与Mdm2作用，激活细胞周期关键的检查点蛋白（checkpointprotein）p53，引发细胞周期G1和G2的的阻滞[7]。本实验中随转染β-1,4-GalT-I质粒浓度的增加p16INK4a和p19ARF的表达上调，提示β-1,4-GalT-I可通过p16INK4a和p19ARF所介导的信号传导途径参与调剂雪旺氏细胞的增殖，这种调剂作用可能与细胞衰老有关。而p27Kip1转变不明显，说明其在雪旺氏细胞的增殖调剂中不发挥关键作用。【参考文献】[1]HuangQ，ShurBD.Overexpressingcellsurfacebetal，4-galactosyltransferaseinPC12cellsincreaseneuriteoutgrowthonlaminin[J].JCellSci,1995,108:839.沈爱国，丁斐，顾晓松，等．β-l，4-半乳糖基转移酶I对Schwann细胞增殖的阻碍[J].解剖学报，2003,34:323.YuQ,CiemervchMA,SicinskiP.RasandMyccandriveoncogeniccellproliferationthroughindividualD-cyclins[J].Oncogene,2005,24:7114.SerranoM,LinAW,McCurrachME,etal.Oncogenicrasprovokesprematurecellsenescenceassociatedwithaccumulationofp53andp16INK4a[J].Cell,1997,88:593.[5]BringoldF,SerranoM.Tunoursuppressorsandoncogencesincellularsenesecnce[J].ExpGerontol,2000,35:317.[6]zhangSW,FuXY,CaoSL,etal.Down-regulationofbeta1,4-galactosyltransferasegeneexpressionbycell-cyclesuppressorgenep16[J].BiochimBiophisActa,1999,1444:49.[7]SherrCJ.TumorsurveillanceviatheARF-p53pathway[J].GenesDev,1998,12:2984