附录蛋白质含量测定精

附录XX蛋白质含量测定组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链，蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证，同时应尽可能选用与待测品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。第一法凯氏定氮法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法除另有规定外，按测定法（1）操作。（1）本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的供试品溶液适量，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法（附录vnD第二法）测定供试品溶液的含氮量，除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。（2）本测定法适用于含有无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的总氮量及非蛋白氮供试品溶液适量，分别置凯氏定氮瓶中，照氮测定法（中国药典2010年版二部附录第二法）测定，以总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量，除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。附注：非蛋白氮供试品溶液制备的常用方法：（1）钨酸沉淀法精密量取供试品适量（蛋白质含量不高于0.2g）置20ml量瓶中，加水10ml，力口10%钨酸钠溶液2ml,0.33mol/L硫酸溶液2ml，加水至刻度，摇匀，静置30分钟，滤过，取续滤液，即得。（可依据蛋白质浓度适当调整10%钨酸钠溶液及0.33mol/L硫酸溶液用量，使钨酸终浓度保持1%。）（2）三氯醋酸沉淀法精密量取供试品适量（蛋白质含量约6〜12mg），加等体积的10%三氯醋酸溶液，混匀，静置30分钟，滤过，取续滤液，即得。（可依据蛋白质浓度适当调整10%三氯醋酸溶液用量，使三氯醋酸终浓度保持5%。）适用范围：本法灵敏度较低，适用于0.2~2.0mg氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中所含氨基酸的结构差异会稍有区别。第二法福林酚法（lowry法）本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质－铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙液，并加水至500ml。对照品溶液的制备除另有规定外，取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.2mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液[取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1~16]4.0ml,立即混匀，置55C水浴中准确反应5分钟，置冷水浴10分钟，照紫外—可见分光光度法（附录IVA），在650nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。适用范围：本法灵敏度高，测定范围为20〜250卩g。本法干扰物质较多，对双缩脲反应产生干扰的离子，同样容易干扰福林—酚反应，且影响还要大。还原物质、酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、甘露醇、糖类、甘油等均有干扰作用。第三法双缩脲法本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂双缩脲试液取硫酸铜1.5g和酒石酸钾钠6.0g，加水500ml使溶解，边搅拌边加入10%氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀，即得。本试剂如有黑色沉淀出现，即不适用。对照品溶液的制备除另有规定外，取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含10mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入双缩脲试液4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外—可见分光光度法（附录IVA），在540nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备方法，自“加入双缩脲试液”起，依法测定，从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。适用范围：本法快速、灵敏度低，测定范围为1〜10mg。本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。第四法2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸法（BCA法）本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+,BCA（2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸）与Cu+结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂铜—BCA试液取2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸钠1g,无水碳酸钠2g，酒石酸钠0.16g，氢氧化钠0.4g与碳酸氢钠0.95g，加水使溶解成100ml,调节pH值至11.25，作为甲液；另取4%硫酸铜溶液作为乙液。临用前取甲液100ml,加入乙液2ml，混匀，即得。对照品溶液的制备除另有规定外，取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.8mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml，分别置具塞试管中，各加水至0.5ml，再分别加入铜—BCA试液10.0ml,立即混匀，置37C水浴中保温30分钟，放冷，照紫外-可见分光光度法（附录IVA），立即在562nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液0.5ml，照标准曲线的制备方法，自“加入铜—BCA试液”起，依法测定，从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。适用范围：本法灵敏度较高，测定范围为80[1g~400（1g。本法测定的样品中不能有还原剂和铜螯合物，否则影响测定。第五法考马斯亮蓝法（Bradford法）本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。试剂酸性染色液取考马斯亮蓝G2500.1g,加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前再滤过。对照品溶液的制备除另有规定外，取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含1mg的溶液。供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液0.0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml分别置具塞试管中，各加水至0.1ml，再分别加入酸性染色液5.0ml,立即混匀，照紫外—可见分光光度法（附录IVA）,立即在595nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算回归方程。另精密量取供试品溶液0.1ml，照标准曲线的制备方法，自“加入酸性染色液”起，依法测定，从回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。附注：本法测定时不可使用石英比色皿（因石英中的二氧化硅会与染色物结合），建议使用塑料或玻璃比色皿。适用范围：本法灵敏度高，可测定1〜200卩g的蛋白量。本法主要的干扰物质有去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等，样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。第六法紫外分光光度法本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在280nm波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。本法干扰因素多，常用于纯化蛋白质的微量测定。对照品溶液与供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法（1）取供试品溶液，照紫外－可见分光光度法（附录IVA），在280nm的波长处测定吸光度，以吸收系数法或对照品比较法计算供试品中蛋白质的含量。（2）取供试品溶液，照紫外—可见分光光度法（附录IVA），在280nm与260nm的波长处测定吸光度，按下式计算供试品中蛋白质的含量。蛋白质浓度（mg/ml）=1.45XA280-0.74XA260适用范围：1、本法操作简便快速，适用于纯化蛋白质的微量检测，一般样品浓度为0.2〜2mg/ml。本法准确度较差，干扰物质多。2、测定法（2）适用于供试品溶液中存在核酸时的蛋白质测定。