HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总

HPLC 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 测胆汁酸含量方法汇总HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总PAGEHPLC方法测胆汁酸含量方法汇总HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总反相高效液相色谱法测定鼠胆汁中游离与结合型胆汁酸试验仪器ArdentLC-1100高效液相色谱仪，附荧光检测器(Agilent公司，美国);WatersNovaC18色谱柱(X150mm,5l.μm)(Waters公司美国)，保护柱及C18柱芯(Phenomenmex公司美国)；ChromabondC18固相萃取小柱(Macherey-Nagel)公司德国)。试验试剂4-嗅甲基-7-甲氧香豆素(BMC)、18-冠醚-6(DCC)，α-鼠胆酸(α-MCA),β-鼠胆酸(β-MCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、胆酸(CA)、猪脱氧胆酸(HDCA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA) 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品及胆酞甘氨酸水解酶均购自美国sigma公司。甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司)，月桂酸(分析纯，上海化学试剂公司)，氢氧化钾、磷酸二氢钾(分析纯，成都化学试剂厂).色谱条件流动相:A相，甲醇:乙睛为1:2(V/V)；B相，超纯水；梯度洗脱程序:65%A(0~8min)，80%A(8~16min)，90%A(16~20min)；柱温：20℃；流速:1mL/min;激发波长:330nm；发射波长：400nm。样品处理样品预处理:取鼠胆汁20μL，加入120μmol/L月桂酸甲醇液50μL，再加入乙睛2mL，充分混匀，超声20min,10000g离心10min，取上清液，在60℃氮气下吹干。胆汁酸的提取:测定游离与甘氨结合型胆汁酸时，将预处理吹干后的胆汁样品溶于2mLL磷酸盐缓冲液(pH7)，加至已活化的固相萃取C18小柱上(用2mL甲醇和5mL蒸馏水依次活化C18小柱)，再用10mL蒸馏水淋洗小柱，最后用3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时，向预处理吹干后的胆汁样品中加入1mg胆酞甘氨酸水解酶，再加入0.025mol/L的磷酸钾缓冲液(pHmL,避光37℃反应30min，再加入mol/L磷酸盐缓冲液(pH7)2mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取C18小柱上，其余 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 同测定游离与甘氨结合型胆汁酸.胆汁酸的衍生与测定:向胆汁酸洗脱液中加入150μL1.8mmol/LKOH甲醇液于60℃氮气下吹干，然后加入10mmol/LBMC乙睛液与5mmol/LDCC乙睛液各50μL，密闭，37℃条件下反应30min，取10μL进样分析.高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸试验仪器API2000质谱仪(加拿大AppliedBiosystens公司)，配备PerkinEInmer200泵和tubro离子源;AtlantisdC18色谱柱，150mmXmm,5μm(美国Waters公司)，保护柱及C18柱芯(美国Phenanenex公司)，ChrcmabondC18ec(3mL/200mg德国Machere-Nagel公司)，Millpore纯水装置(美国Millpore公司)。15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)。试验试剂15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)。色谱条件柱温:25℃；流速:1mL/min分流比为1:4；流动相A:5mmo1/L醋酸铵和%甲酸水溶液；B:5mmo1/L醋酸铵和0O1%甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序为:Omin（80%B)9min%B)10min(80%B)15min(80%B)。样品处理蛋白沉淀法：800μL乙睛中加入300μL血清，混匀1min,超声30min以15000Xg离心15min,取900μL上清液60℃氮气吹干，其余同固相萃取。固相萃取法：依次用1mL甲醇,%甲酸溶液活化固相萃取小柱。1mL%甲酸溶液中加入300μL血清，混匀1min后上小柱。依次用1mL%甲酸溶液、1mL甲醇水溶液(45:55,V/V)冲洗。在重力作用下滴干后，真空抽干。再用L5mL甲醇洗脱，洗脱液在600C氮气吹干，残余物溶于100μL流动相(A:B=20:80，V/V)中，漩涡混匀lmin超声2min。取20μL进行HPLC-MSIMS分析，检测时间15min。高效液相色谱法同时测定胆汁中9种结合型胆汁酸试验仪器Shimadzu2010LC-AHT高效液相色谱仪，附紫外检测器(日本Shimadzu公司);Aglient固相萃取装置(美国Aglient公司);Millipore纯水装置(美国Millipore公司)；ChromabondC18固相萃取小柱(德国Maeherey-Nagel公司)；牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholicacidTUDCA)、牛磺胆酸(CTaurocholicacidTCA)、甘氨胆酸(Glycocholicacid,GCA)、甘氨石胆酸(Glycol-ithochdicacid,GLCA)、甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholicacid,GDCA)牛磺脱氧胆酸(CTaurodeoxycholicacidTDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GlycochenodeoxycholicacidGCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸门，aurochenodeoxycholicacid,TCDCA)、牛磺石胆酸CTaurolithocholicacidTLCA)标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛(色谱纯，美国Tedia公司)，其余试剂均为分析纯。试验试剂牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholicacidTUDCA)、牛磺胆酸(CTaurocholicacidTCA)、甘氨胆酸(Glycocholicacid,GCA)、甘氨石胆酸(Glycol-ithochdicacid,GLCA)、甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholicacid,GDCA)牛磺脱氧胆酸(CTaurodeoxycholicacidTDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GlycochenodeoxycholicacidGCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸门，aurochenodeoxycholicacid,TCDCA)、牛磺石胆酸CTaurolithocholicacidTLCA)标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛(色谱纯，美国Tedia公司)，其余试剂均为分析纯。色谱条件谱柱为WatersNovaC18柱mmx150mm,5μm)，流动相为甲醇一60mmol/L磷酸盐缓冲液(66:34,v/v),pH，等度洗脱，柱温25℃，流速：ml/min;检测波长:197nm，进样量为10μL。样品处理方法1:取胆汁样品25μL，加入乙睛ml，旋涡震荡混匀，超声20min,10000g/min离心10min，取上清液2ml,60℃氮气下吹干。将预处理吹干后的汁样品溶于2mlmol/L磷酸盐缓冲液(pH，加至己活化的固相萃取C18小柱上(预先用2ml甲醇和5ml蒸馏水依次活化C18小柱)，再用10ml蒸馏水淋洗小柱，最后用3ml甲醇洗脱胆汁酸。洗脱液在60℃氮气下吹干后溶于200μL流动相，超声30s,lOμL进样。血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定试验仪器1100型高效液相色谱-质谱联用仪(Agilent公司)，配备四元梯度泵，100位自动进样器，荧光检测器，在线真空脱气机，大气压化学电离源(APCI);HypersilC18色谱柱mmX200mm,5μm,中国科学院大连化学物理研究所)。1,2-::苯并-3,4-二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯(自制);胆汁酸标准样品(Sigma公司);无水乙睛(禹城化学试剂厂)，用P2O5干燥后蒸馏处理，二甲基亚矾经减压蒸馏后备用;柠檬酸钾、酒石酸钠等均为分析纯，实验用水由Milli-Q超纯水系统制备。试验试剂标准溶液的配制：准确称取定量胆汁酸标准品，用乙睛配成L的溶液。称取mg的1,2-:苯并-3,4二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)用二甲基亚矾定容至lOmL,浓度为mo1/L。相应低浓度的衍生试剂(500μmol/L)标准溶液用二甲基亚矾稀释，低浓度胆汁酸(50μmol/L)标准溶液用无水乙睛稀释而成。色谱条件色谱柱:HypersilC18色谱柱mmX200mm,5μm)。流动A:50%乙睛水溶液(含有40mmo1/L的HCOONH4,pH=;B:100%的乙睛。梯度洗脱程序为(0%B35min线性梯度到70%B到40min线性梯度到10(ploB,100%B再运行15min流速为min柱温300℃。荧光激发波长和发射波长分别为:λex=333nm,λem=390nm.质谱条件:1100型高效液相色谱领谱联用仪;大气压化学电离源(APCI)，正离子模式，喷雾压力MPa;干燥气流量为5L/min燥气温度350℃，气化温度450℃;毛细管电压3500V，电晕电流4000nA样品处理标准品的衍生过程：盛有500mg柠檬酸钾催化剂的安培瓶中依次加入100mLDMS0,50μL混合胆汁酸溶液，150μL衍生试剂溶液，封口后于95℃恒温水浴下振荡反应30min取出放冷后加入300μL乙睛混合均匀，取上层溶液用乙睛水溶液(CH3CN/H20,1:1,V/V)稀释5倍直接进样分析。血清中胆汁酸的提取：向盛有2mL血清样品的离心试管中加入3mL甲醇并振荡摇匀，然后加入硫酸按固体超声振荡，离心后取出有机相用氮气吹干，剩余物用300mLDMSO溶解后加入mL水。然后用经过4mL甲醇和5mL水冲洗的C18Sep-Pak萃取柱过滤，再用5mL水冲洗萃取柱，然后用5mL乙睛将胆汁酸洗脱，将洗脱液挥发至干用300mLDMSO溶解冷藏备用。柱前衍生反相高效液相色谱法测定血清中9种胆汁酸试验仪器LC-6A高效液相色谱仪，RF-535荧光检测器(日本，岛津公司);玻璃管均硅烷化。试验试剂胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)(Sigmaaldrich公司)。BMC(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素),DCC(18-冠醚-6)(Sigmaaldrich公司)，甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司)，氢氧化钾、磷酸二氢钾、月桂酸均为国产分析纯。色谱条件WatersNovaC18色谱柱X150mm,5μm)。柱温25℃。荧光检测:激发波长330nm，荧光波长410nm。流动相A:三蒸水;流动相B:乙睛:甲醇=2:1(V/V)，流速1mL/min，梯度洗脱程序:0.0min,65%B;8.0min,65%B;min,80%B;min,80%B;19min,90%B;24min,90%B。以月桂酸为内标定量。样品处理将40μmol/L内标液50μL加到250μL血清中，加甲醇4mL充分混匀。超声震动20min,4000r/min离心20min，取上清液，在60℃用氮气吹干。依次用2mL甲醇,6mL磷酸钾缓冲液mol/L，pH7.0)活化Sep-PakC18小柱。将以上吹干的残余物溶于10mL磷酸钾缓冲液mol/L,pH,以mL/min流速通过。活化后的C18小柱依次用6mL磷酸钾缓冲液mol/L,pH,10mL蒸馏水冲洗(流速1mL/min)，最后用3mL甲醇洗脱(流速mL/min)。洗脱液在60℃用氮气吹干。