实验蛋白质标准曲线的制作

实验蛋白质标准曲线的制作关于实验蛋白质标准曲线的制作第一页，共十三页，2022年，8月28日一、实验目的学习考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度的原理和方法第二页，共十三页，2022年，8月28日二、实验原理一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。第三页，共十三页，2022年，8月28日考马斯亮蓝G－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范...

关于实验蛋白质标准曲线的制作第一页，共十三页，2022年，8月28日一、实验目的学习考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度的原理和方法第二页，共十三页，2022年，8月28日二、实验原理一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。第三页，共十三页，2022年，8月28日考马斯亮蓝G－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’slaw）。此染料与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残结合，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。第四页，共十三页，2022年，8月28日第五页，共十三页，2022年，8月28日蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。第六页，共十三页，2022年，8月28日三、实验仪器和试剂（一）试剂1.考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G－250100mg溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%H3PO4，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2.标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。第七页，共十三页，2022年，8月28日（二）器材721型分光光度计、移液管（1mL，5mL）、试管及试管架第八页，共十三页，2022年，8月28日四、实验步骤试管编号0123451mg/mL标准蛋白（mL）00.20.40.60.810.15mol/LNaCl（mL）10.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂（mL）555555充分摇匀，20min内以0号管为空白对照,在595nm测定A595nm－第九页，共十三页，2022年，8月28日以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为200µg、400µg、600µg、800µg、1000µg），在坐标轴上绘制标准曲线。1.利用标准曲线查出回归方程。2.用Excel作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X。相关系数一般大于0.9。3.未知样品蛋白质浓度的测定：第十页，共十三页，2022年，8月28日测定方法同上，取合适体积的未知样品(奶粉，1g奶粉溶于30mL0.15mol/LNaCl，3000rpm离心5分钟，取上清待用)，使其测定值在标准曲线的直线范围内（0～1000µg），根据所测定的A595nm，利用标准曲线或回归方程求出相当于标准蛋白质的量（µg），从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。一般被测样品的A595nm值在0.1—0.5之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以减少取样量，如果仍然很大，可以定量稀释后再进行测定。第十一页，共十三页，2022年，8月28日五、注意事项：（一）蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内基本稳定。如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（二）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。3．测定时仅使用一套比色杯（2个），并从低浓度到高浓度依次测定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯，仅用待测液润洗2～3次即可。另外，还要注意，玻璃仪器要洗涤干净并保持干燥，避免温度变化；取量要准确；分光光度计十分灵敏，测定时要认真仔细。第十二页，共十三页，2022年，8月28日*感谢大家观看第十三页，共十三页，2022年，8月28日

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