高效液相色谱法123

第12章高效液相色谱法highperformanceliquidchromatographyHPLCHPLC与经典LC区别经典液相色谱固定相颗粒较大，不均匀常压下输送流动相柱效低 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 周期长现代液相色谱固定相颗粒小，均匀高压下输送流动相柱效高分析周期短第2节基本理论-速率理论一、柱内展宽H?A?B/u?(Cm?Csm?Cs)uCsm为静态流动相传质阻力系数1.涡流扩散项A组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰展宽。影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度减少方法：a降低dp：目前商品柱多采用3-5μm粒径b降低λ：采用球形、均匀分布固定相。2.纵向扩散项B/u样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起峰展宽B=2γDmDm∝T/η液相色谱中Dm比GC中小105u是最佳流速的3-5倍B/u忽略3.流动的流动相传质阻力项Cmu流动相本身，处于不同层流的分子具有不同流速。Cm?d/DmDm∝T/η2p减免方法：1）减少固定相颗粒直径2）减少流动相液体黏度（甲醇）4.静态流动相传质阻力项Csmu原因：处于固定相颗粒内部孔洞内静态流动相引起影响Csmu的因素与Cm相同5.固定相的传质阻力项Csu影响因素：固定相内部阻力影响Cm?d/Ds减免方法：减少固定相液膜厚度——化学键合相2f6、HPLC法中分离条件的选择H=A+（Cm+Csm）u1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min3.柱温的选择：0选室温25-30C左右。太低，流动相黏度增加，太高容易产生气泡二、柱外展宽从进样器到检测器之间的体积称柱外死体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。减免方法：应尽可能减少柱外死体积第3节各类高效液相色谱法吸附色谱法化学键合相离子对色谱法一、吸附色谱法1．分离原理2．固定相：极性和非极性固定相3．流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂二、化学键合相色谱法（bondedphasechromatography,BPC）化学键合相：采用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上。优点：固定相不易流失适用于各种样品的分离分析分类?正相键合相色谱法：极性键合相，如氨基柱、氰基柱适用：极性化合物?反相键合相色谱法：非极性键合相，如C18柱、C8柱适用：非极性至中等极性化合物1、反相键合相色谱法（RP-HPLC）1）分离原理流动相与溶质有排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆的。k↓，组分tR↓反相键合相色谱法（RP-HPLC）2）固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱）十八烷基键合相：常用的非极性键合相R1SiOH+ClR1C18H37SiOSiR2SiR2C18H37+HCl键合相分类高碳型：R1、R2是两个甲基特点：载样量大，保留能力强中碳型：R1、R2其中一个是氢，一个为氯低碳型：R1、R2都是氯表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目，占硅胶表面硅醇基总数的比例。作用：决定了键合相是分配还是吸附占主导封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子进行钝化处理。反相键合相色谱法（RP-HPLC）3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，四氢呋喃反相键合相色谱法（RP-HPLC）4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5）出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6）适用：非极性-中等极性组分例：用ODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇-水（95：5）问：①哪个先出柱②若要增大tR，应增大甲醇还是水的比例?2、正相键合相色谱法（NP-HPLC）1）分离机制：2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相3）流动相：极性小底剂+有机极性调节剂?例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇正相键合相色谱法（NP-HPLC）4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5）出柱顺序：极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6）适用：氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氨基键合相：糖类等3．离子对色谱法（IPC或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱四丁基季胺盐→分析酸2）影响k的因素a．与m的极性有关（同反相色谱）b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑3）适用：较强的有机酸、碱3．洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）PhenomenexLunaC18（250mm×4.6mm，5?m）色谱柱(Aschaffenburg,Germany)。流动相：(A)乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱：0-30min：A28%，B72%；30-53min：A28％升至34％，B72％降至66％；53-70min：A34％升至80％，B66％降至20％。流速：1.0ml·min-1；检测波长：275nm；进样量：20μl；柱温：30℃；DAD1E,Sig=275,16Ref=off(F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG035.D)mAULuna20001020DAD1E,Sig=275,16Ref=off(F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG050.D)mAU201000102030VWD1A,Wavelength=275nm(F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG051.D)mAU10050001020DAD1E,Sig=275,16Ref=off(F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG054.D)mAU755025001020DAD1E,Sig=275,16Ref=off(F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG057.D)mAU100500010203040506070min30405060703040506070min40506070min3040506070minKromasilZobaxEclipseZobaxExtendminZobaxSB流动相的性质和选择1、流动相的物理性质1)流动相要求：①易得易纯化，无毒不易燃。②检测器的适应性:如紫外检测器对溶剂的透明波长要求；示差折光不能用梯度洗脱③对样品有一定溶解度而不反应-4④纯净,低廉,低粘度(5×10Pa.S),低沸点(>柱温(20~50))2)流动相的物理性质沸点bp、分子量M、密度、介电常数e粘度η、折射率RI、紫外吸收截止波长溶剂强度参数ε(Al2O3)、溶解度参数δ(色散δd、取向极性δ0、受质子δa/给质子δh)、溶剂极性参数P(质子接受xe、给质子xd、偶极xn)、选择性分组、表面张力、离子对色谱溶剂强度/(P+0.25e)常用于HPLC流动相溶剂的性质溶剂全氧烃正戊烷正已烷正庚烷环已烷P/<-200.10.2-0.2ε0.2500.010.010.040.180.320.230.320.457XeXdXn选择四氯化碳1.6苯2.7甲苯乙醚二氯甲烷正丙醇2.42.83.14.00.290.380.420.820.250.530.290.540.280.130.180.190.470.340.530.277152正丁醇3.90.70.590.190.252四氢呋喃乙酸乙酯氯仿甲乙酮二氧六烷吡啶硝基乙烷丙酮乙醇乙酸乙腈DMF二甲亚砜4.04.44.14.74.85.35.25.14.36.05.86.47.20.570.580.400.510.560.710.600.500.881.00.650.750.380.340.250.350.360.410.280.350.520.390.310.390.390.200.230.410.220.240.220.290.230.190.310.270.210.230.420.430.330.430.400.360.430.420.290.300.420.400.393677637624633/①溶剂的强度因素ε,P规定：戊烷在Al2O3的ε=0ε(硅胶)=ε(Al2O3)×0.77混合溶剂??0ABlg[NB.10.nB(???)?(1?NB)]????.nB0A?0B0AN摩尔分数;nB为吸附剂吸一个B分子所占面积,β吸附剂活性。一般0.6≤β≤1.0,nB=4-6随B分子体积而变化ε0：液-固色谱中溶剂强度参数，反映溶剂分子对吸附剂亲和力。经验：ε0减小0.05，k值增加1~3倍②溶解度参数δEcEC是1mol气体变液体释放能量;??Vm液体摩尔体积Vmδ=色散δ+偶极δ+接受质子δ+给出质子δ/③极性参数PP':液-液色谱溶剂极性参数，表示溶剂洗脱强度和溶剂的选择性p?lg(Kg)乙醇?lg(Kg)二氧六烷?lg(Kg)硝基甲烷Kg为极性分配系数/经验：P'改变2单位，k值改变10倍极性参数P与溶剂强度参数关系[投影]溶剂PXeXdXn溶剂PXeXdXn正戊烷正已烷苯00.1乙醇乙酸乙酯4.34.45.10.520.190.290.340.230.430.350.230.422.70.230.320.45丙酮乙醚正丙醇氯仿2.80.530.130.34甲醇4.00.540.190.27乙酸4.10.250.410.335.15.86.00.480.220.310.310.270.420.390.310.30二氯甲烷3.10.290.180.53乙腈四氢呋喃4.00.380.200.42水10.20.370.370.25④粘度参数注意:溶剂常用0.4-0.5mPa.s,太大柱效下降,大小易成气泡,混合时一般粘度变化非线性12341.正丙醇2.乙醇3.甲醇4.乙腈水0B1002、溶剂的选择性与分类(Snyder)K与分子之间作用力？色散力、偶极力、氢键力参考物的选择(Snyder法)强偶极作用------硝基甲烷-------Xn质子给予体------乙醇-------------Xd质子接受体------二氧六环-------Xe参考物与被检溶剂间作用力关系表给质子—乙醇被检溶剂接受质子作用力Xe作用力参考物受质子—二氧六环给质子作用力Xd强偶极—硝基甲烷偶极作用力Xnxe?log(Kg)乙醇/p/表2Snyder的溶剂选择性分组/混合溶剂P：?P???iPi//表混合溶剂的溶剂特性注:模糊聚类法把溶剂对质子给予体、质子接受体、电子给予体、电子接受体和定向作用力化合物的选择性五个参数进行分类，选择21种常用溶剂举例：在反相色谱中，计算甲醇-水(60:40)的溶剂溶剂强度，如果改用相同强度的乙腈-水溶剂，四氢呋喃和水其比例是多少？解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和水的溶剂强度S分别为2.6,3.2,4.5,0甲醇-水：S=0.60×2.6+0.40×0=1.56乙腈-水S=X×3.2+(1-X)×0=1.56X=0.49THF-水S=X×4.5+(1-Y)×0=1.56Y=0.352)选择一般原则正相键合相反相键合相主体溶剂正已烷(正庚烷、正戊烷)水选择性溶剂a.质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚甲醇*b.质子给予体氯仿乙腈*c.偶极二氯甲烷四氢呋喃*3溶剂优化的步骤：1.首选择溶剂2.多元溶剂系统组成/3.洗脱能力的选择(ε,P,S)调k重点组分k=(t-t0)/t0≈34.改变溶剂系统改变选择性5.混合溶剂优化6.PH缓冲剂、胺、配合物、添加剂离子强度调节剂7.组分性质差别大可用梯度洗脱如:四面体-三角形法1选择乙腈-水,2.比例100%往下调节确定k值而得最适合的比例.图9-293.改变溶剂:甲醇-水;THF-水比例计算找等洗脱强度三角形图9-304.混合溶剂:三元、四元图9-335.七种溶剂流动相色谱分析图9-344、色谱分离条件的优化指标1)色谱响应系数PiCRF??ln??(tM?tL)P0i?1其中:P=f/g,n相邻峰对数;tM最大容许时间,tL实际时间，α常数n2)色谱优化函数RiCOF??Ailn??(tMRidi?1nAi权重因子,R分离度?tL)COF绝对值越大越差[举例]取代萘混合物分离的优化试验色谱柱：Zorbax-C8（150×0.46cm）1.选择溶剂强度使溶质容量因子在1~10选择二元溶剂溶剂%有机相近似k值(计算值实验值)乙腈52520.7~8A甲醇64630.6~8B四氢呋喃37390.6~7C取值:乙腈3.2;甲醇2.6;四氢呋喃4.5水02、作下列流动相的色谱图,求β=0,Ai=1,Rd为1.2;1.8;2.4时COF值C:A+BD:B+CE:C+AF:A+B+C表ZorbaxC8柱上取代萘的COF值流动相COFRd=1.21.82.4-0.248-3.21-3.79-0.248-2.89-3.18-0.99-1.80-2.380.00-0.12-0.38-4.97-5.78-6.53-2.48-3.41-4.270.00-0.38-.0670.00-0.07-.036AA+BBB+CCC+AA+B+C最佳61%B+39%C