生殖免疫学检查方法 ppt课件

生殖免疫学检查方法中山大学第二附属医院妇产科刘玉昆复发性自然流产病因复杂，包括解剖、内分泌、遗传、感染等因素，但仍有50%以上的患者病因不明大局部原因不明的复发性自然流产患者与免疫因素有关，包括自身免疫和同种免疫常用的生殖免疫学检查方法根本原理在复发性自然流产诊治中的价值和地位抗磷脂抗体抗磷脂抗体属一类针对各种带负电荷磷脂的自身抗体，临床上常与复发性动静脉血栓形成、复发性自然流产、血小板减少症等密切相关磷脂抗体的靶抗原实际上是磷脂/磷脂结合蛋白复合物能形成此复合物的磷脂有：磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰酸、磷脂酰胆碱等，因此形成相应的多种磷脂抗体抗心磷脂抗体和狼疮抗凝因子抗磷脂抗体是一种强烈的凝血活性物质，激活血小板，促进凝血，导致血小板聚集，血栓形成同时可直接造成血管内皮细胞损伤，加剧血栓形成，使胎盘循环发生栓塞，胎盘梗死，导致流产直接影响绒毛滋养细胞的生长、分化与侵入抗磷脂抗体与复发性自然流产关系密切曾经有过自然流产史并且ACA高水平者，RSA发生率达70%，曾经自然流产≥3次，ACA阳性者，再次自然流产机率可达90%RSA患者APA阳性发生率15-20%，而无自然流产者阳性率为2-5%，且其中ACA阳性者大局部为低度阳性Harris等调查1000名非选择性产科病人，结果2%患者ACAIgG阳性，4%IgM阳性，其中80%是弱阳性，只有0.2%的IgG和0.7%的IgM为中、重度阳性狼疮抗凝因子〔LA〕1952年，Conley和Hartmam发现两位因凝血酶原时间和全血凝块时间延长而有出血性疾病的SLE患者中存在一种“抗凝物〞，1972年正式命名其为LA是抗磷脂抗体的一种LA的实验室检查在体外实验中，LA能通过与磷脂外 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 结合而阻断钙依赖性的凝血酶原酶复合物的形成，从而使APTT延长。筛查实验：活化局部凝血活酶时间〔APTT〕进一步确证实验在患者血浆中参加正常血浆，APTT延长不能得到纠正在血浆中参加过量磷脂，APTT可以得到纠正某些药物也可导致的LA生成，如hydralazine,chlorpromazine,procainamide药物导致的LA在停药后可逐渐消除应用抗凝剂时会影响LA的测定结果注意抗心磷脂抗体〔ACA〕抗心磷脂抗体的检测方法目前最常用的为酶联免疫吸附法〔ELISA〕原理：酶标板经牛心磷脂包被，以含20%成年牛血清的PBS封板，参加稀释的待测血清，孵育1小时，洗涤，加HPH-抗人IgG，洗涤后加底物，于酶标仪上判断结果注意问题感染性疾病〔如梅毒、疟疾、甲肝、丙肝、结核、爱滋病、巨细胞病毒、B19微小病毒等〕可使ACA呈阳性反响阳性者需6~8周后复查ACA检验结果应以阴性、弱阳性、中度阳性、强阳性表示，少局部正常人呈弱阳性，以中度阳性、强阳性的临床意义最大ACA的检测结果受靶抗原浓度、酶标板的敏感度、适宜的缓冲液等影响，因此各实验室的检验结果可能有一定差异ACA作用的靶抗原实际上是磷脂与β2糖蛋白的抗原复合物，因此在磷脂抗体ELISA检测系统中，必须提供足够量与浓度稳定的β2糖蛋白。ACA和LA有密切相关性，但二者不同，因此二者都应检测抗磷脂抗体与不孕抗磷脂抗体能否引起不孕？反复IVF失败者是否需检测抗磷脂抗体？阳性者是否需治疗？报道不一致系统综述说明：抗磷脂抗体引起不孕的证据缺乏不支持对IVF失败者常规进行抗磷脂抗体的检测对抗磷脂抗体阳性的不孕患者是否需要干预还有争议抗核抗体〔ANA〕ANA是指针对细胞核内成分所产生的抗体细胞核内成分复杂，有核糖核酸、脱氧核糖核酸、酶、蛋白等，抗核抗体是指抗细胞核内的RNA、DNA，各种酶和蛋白质等的总称包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体临床上常用的测定方法为间接免疫荧光检测ANA并不象ACA一样与RSA与密切关系尽管ANA在RSA中似乎更常见，但他们的存在并不能预测妊娠的结局与自然流产有关？Fausett总结了目前的研究资料，认为：ANA阳性可能只是提示机体其它自身抗体〔特别是APL〕的存在例如有三项研究发现在RSA患者中，ANA阳性者其APL的阳性率分别为17%、71%、100%。没有合理、有效的治疗手段不支持在RSA患者中常规进行ANA筛查不支持对不孕患者常规进行ANA的检测抗精抗体〔ASA〕抗精抗体是机体产生的针对精子抗原的抗体由于机械屏障的破坏、炎症等原因，男女双方的机体内可产生抗精抗体男方还是女方产生的部位何种检查方法抗精抗体检测技术1.以精子膜提取物抗原检测体液标本精子抗体的方法：如酶联免疫吸附法敏感、高效、检测样本用量少，主要用于检测血清中的抗精抗体提取过程对蛋白分子的损伤，膜内侧的成分等可能与血清中存在的自身抗体发生结合以酶联免疫试验检测血清、宫颈黏液的抗精子抗体，不明原因不育夫妇及抗体阳性妇女间体外受精和妊娠率，并无明显差异以精子膜提取物作为抗原的检测技术仍有很大缺陷2.以活动精子检测体液标本中精子抗体的方法：如凝集试验、精子制动试验等以活精子作为抗原载体，有助于排除精子内部成分的干扰精浆中的精子抗体主要以与精子结合的形式存在，因此本法主要用于检测血清标本血清中的精子抗体难以直接作用于精子外表，并干扰生殖，其临床意义尚难以确定3.活精子外表附着抗体的检测：如免疫珠试验和混合抗球蛋白反响试验用抗人免疫球蛋白抗体包被的聚丙烯酰胺微球能结合于结合了精子抗体的精子外表，在相差显微镜或电子显微镜下可见到此种免疫珠随精子向前进而移动。判断标准为外表有免疫求蛋白的精子在总活动精子中所占的比例按照世界卫生组织人类不育的病因诊断分来，诊断免疫因素不育的唯一依据为活动精子外表附着免疫求蛋白。相应技术为免疫珠试验和混合抗球蛋白反响试验干扰精子穿过宫颈黏液、透明带及卵细胞膜，使受孕率降低抗精抗体免疫性不孕抗精抗体自然流产抗精抗体与流产尚无定论有报道：引起自然流产的抗精抗体主要是女方血清中的抗精抗体其机理可能为ASA作用于滋养层细胞，从而影响胚胎的生长发育，导致流产封闭抗体的检测母胎免疫耐受的机制之一：封闭抗体胚胎所携带的夫源性HLA抗原〔滋养细胞外表〕能刺激母体免疫系统，并产生一类IgG型抗体，称之为封闭抗体。封闭抗体一方面可与母体淋巴细胞外表抗原结合，也可与滋养细胞本身结合从而阻断母胎之间的免疫识别和反响习惯性流产患者常缺乏封闭抗体，使母体免疫系统容易对胎儿产生免疫攻击，导致流产以此为依据，对缺乏保护性抗体的患者采用异体免疫治疗，封闭抗体转为阳性后再妊娠，成功率显著提高目前国际上许多医疗中心把封闭抗体的测定作为复发性自然流产免疫治疗的指征之一，并用于判定疗效封闭抗体检测方法补体依赖性细胞毒实验单向混合淋巴细胞反响流式细胞仪检测抗丈夫淋巴细胞抗体补体依赖性细胞毒试验根本原理：女方血清内存在的封闭抗体与男方外周血淋巴细胞结合，并在补体介导作用下致细胞细胞死亡，经胎盘蓝或伊红染色，在相差显微镜下读取死细胞数及计算细胞毒指数，细胞毒指数﹥20%为阳性。单向混合淋巴细胞反响检测封闭抗体根本原理：用男方外周血淋巴细胞经丝裂霉素处理后作刺激细胞，女方外周血淋巴细胞作为反响细胞做单向混合淋巴细胞培养。在实验中，让女方血清作为培养基质，与AB型供者血清作培养基质比较，观察这两种基质对一对夫妇妇方外周血淋巴细胞对男方外周血淋巴细胞反响的影响。计算出封闭效率，封闭效率大于5%时为封闭效率阳性流式细胞仪检测抗丈夫淋巴细胞抗体女方血清丈夫淋巴细胞共培养PEFITC尽管目前许多实验室用封闭抗体来评价患者的同种免疫状况，并且对临床也有一定的指导价值，但由于目前母胎免疫耐受的机制尚未完全说明，封闭抗体只是导致自然流产的可能机制，目前为止，尚无直接证据，因此只能作为一个参考。并且即使在正常妊娠，封闭抗体也会阴性另外有研究发现，B细胞缺乏鼠仍可成功妊娠。NK细胞毒性测定NK细胞毒性测定是目前一种比较新的评价习惯性流产患者免疫状况的方法。研究说明妊娠期母体外周血NK细胞活性明显下降，而在RSA患者孕期及非孕期的外周血NK细胞活性均较正常妇女明显升高，并且与妊娠结局直接相关。应用免疫球蛋白或淋巴细胞免疫治疗后，NK细胞毒性明显下降，且有良好的妊娠结局NK细胞毒性测定已成为诊治自然流产患者的检测指标之一NK细胞毒性测定方法流式细胞仪法流式细胞仪测定NK细胞毒性靶细胞PKH2NK细胞共培养PI死亡靶细胞PIPKH2NK细胞毒性测定结果NK细胞毒性大于15%将明显损害胚胎，在妊娠前及妊娠后必须将其降至15%以下。降低NK细胞毒性的方法有静脉滴注丙种球蛋白和淋巴细胞免疫治疗周期第6、7、8天用球蛋白3天，48小时后测NK细胞毒性抑制受孕未抑制每月检测NK细胞毒性，直至抑制后受孕淋巴细胞免疫治疗，封闭抗体阳性后，NK细胞毒性可下降50%左右，因此对球蛋白无效者可用，也可直接用〔经济〕妊娠后，应每月复查NK细胞毒性，使其低于15%妊娠后才检测NK细胞毒性高者，如B超、HCG正常，可用免疫球蛋白，但效果不如孕前用，如不用结局更差抗甲状腺抗体Stagnaro等首次报道抗甲状腺抗体与妊娠丧失有关，后来不少学者相继报道。Pratt等的研究说明，在抗甲状腺抗体阳性的RSA患者中，其ACA阳性率没有增高，提示抗甲状腺抗体可能是RSA的一个独立危险因素。Singh等研究发现，抗甲状腺抗体阳性患者中，自然流产发生率达32%，而阴性组为16%。Steck等研究发现在RSA组中，抗甲状腺抗体阳性率为36%，而在正常对照组为9%〔初产妇〕4.5%〔经产妇〕。然而也有一些相反的报道，认为抗甲状腺抗体与RSA无关。综合文献报道，目前大多数报道认为抗甲状腺抗体阳性与RSA有关，但尚缺乏直接证据。抗甲状腺抗体导致流产的机制也不清楚。把甲状腺功能测定、抗甲状腺抗体作为常规检查工程认为抗体在损害甲状腺的同时，也激活了自然杀伤细胞，从而导致对子宫、胚胎等其他器官的损害，也会引起流产他们尝试用淋巴细胞免疫治疗和静脉免疫球蛋白治疗，取得了较好的疗效。据报道，35例抗甲状腺抗体阳性的RSA患者，曾经尝试过10次的宫腔内受精、4次IVF，均失败，后经免疫学检查发现，NK细胞活性明显增高。经过LIT和IVIG治疗后，再次行IVF或IUI，60%成功妊娠