常用的单克隆抗体检测方法

常用的单克隆抗体检测方冻时间：2021.03.06创作：欧阳道通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，柱杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本丈介绍了几种帝用的抗体检测的方出（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底杨显色反应的需效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敎度嵩,现己/•泛用于筛选和鉴定单抗。⑦器材和试別a、包菠缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/LNa2CO38mL0.2mol/LNaHCO317ml混合，再加75ml蒸馆水，调PH至9.6oTris-HCl缓冲液（PH8.0,0.02mol/LJ:取0.lmol/LTris100ml,O.lmol/LHC158.4ml混合，加蒸镭水至1000mlob、洗涤缓冲液fPH7.2的PBS丿：KH2PO40.2g,KC10.2g,Na2HPO4・12H2O2.9g,NaCl8.0g,Tween-200.5mL加蒸馆水至1000mloc、稀猝液和封闭液：牛血请自卷勺（BSA丿O.lg,加洗涤液至100mb或用洗涤液将•小牛血请配成5・10%使用。d、酶反应终止液（2mol/LH2SO4J:取杀馆水178.3ml,厲加浓硫酸（98%丿21.7mloe、底炀缓冲液（PH5.0,璘酸盐■柠檬竣缓冲液丿：取0.2mol/LNa2HPO425.7ml,0.1ml/L柠檬酸24.3ml,再加50ml蒸馆水。柠檬酸涿液及配成的底扬缓冲液不稔定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f、底炀使用液：OPD底扬使用液(测490nm的OD值丿：OPD5mg,底物缓冲液10ml,3%H2O20.15mloTMBS或TMB底物使用液(测450nm的OD值丿：TMBS或TMB(1mg/ml)1.0ml,底杨缓冲液10ml,1%H2O225uloABTS底物使用液(测410nm的OD值丿：ABTS0.5mg,底杨缓冲液lml,3%H2O22ulog、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上请作为阴性对照，以免疫亂血请作为阳性血请。h、抗原：可滚性抗原：尽量纯化，以获得嵩特异性。病毒感染的传代细胞或全前抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗氯抗体或酶榇SPA或其他类似试利。j、细胞固文浚：・20°C丙驅；或丙酌■甲醴固定液：Na2HPO4100mg,KH2PO4500mg,蒸馆水150mL丙酮225ml,甲醴125ml；或丙齣■甲愍涿液仃；1丿；或・20°C甲醉。k,聚笨乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。1、酶联免疫阖读仪；或光镜。m、吸管、加样器及水浴箔、离心机等。②可嫁性抗原的酶联免疫吸附试唸(ELISA丿a、纯化抗原用包彼液稀释至l・20ug/ml。b、50-100U1/孔量加入酶榇板孔中，置4°C过夜或37°C浹附2小时。c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液冼3次，毎次3・5分钟，拍干。d、毎孔加200山封闭液4°C过夜或37°C封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。e、冼涤液洗3次；此时包彼板可・20°C或4°C保存备用。f、每孔加50-100U1待检杂交瘤细胞培养上请，同时设立阳性、阴性对照和空勺对照；37°C孵育1・2小时；洗涤，拍干。g、加酶棕第二抗体，每孔50・1OOul,37°C孵育1・2小时，洗涤，拍干。h、加底杨液，每孔加新鮮配制的底扬使用液50-1OOul,37°C10・30分钟。i、以2mol/LH2SO4终止反应，柱酶朕免疫阅读仪上读取OD值。j、结果判定：以P/N2.1,或PN+3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔朗确显色，则可直接用肉眼观疼结果。③全蔺抗原的ELISASa,新鮮培养的细苗用蒸馆水或PBS悬浮，并调整细茵浓度至1X108个/ml。必、须指出，对于人畜共患病病原体需注意妄全操作，最好是夭活戏理。b、每孔中加100山5%比二議涿液（0.1mol/LNaHCO395ml+25%戊二議澹液5ml丿,37°C作用2小时，蒸馆水洗涤3次；加上述细蔺悬液50ul/孔；37-56T烘干；毎孔加200ulH闭液4°C过夜或37T2小时封闭。c、步骤b也可采用先每孔加50ul细茵悬液，37°C・56°C烘干，然后用・20°C预冷的无水甲醸宝温作用15分钟，蒸馆水冼涤3次；毎孔加200ulH闭液4°C过夜或37°C2小时封闭。d、洗涤液冼3次；此时包彼板可-20°C或4°C保存备用。e、以下步骤同上法。⑥用全细胞抗原的ELISAa,按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。b、淋巴细胞悬液的制备采用新鮮外周血加肝素抗凝后，譎加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm禹心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鮮淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氣化鞍嫁液，宝温10分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液科猝至适多浓度。c、每孔加1OOul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5X104个；1500r/min15分钟，甩去上请；宝溫干燥或吹干后用丙酌■甲醉ri：1J4T10分钟；可4°C或-20存备用。d、以下步骤同上出。⑤抗体柿按ELISA忒验本比用抗BALB/c小亂Ig的多克隆抗体嫦捉待检样醃中的MeAb,再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底扬显色。该比是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：a、以适.当浓度的纯化抗亂Ig抗体包彼酶榇板，每■孔加lOOul,37°C2小时或4°C过夜。b、洗涤、拍干后加待测的McAb样％,37T1-2小时。c、洗涤后加适量的抗廉，37T1-2小时。d、洗涤后加入酶标多克隆抗体，37T1・2小时°洗涤后加底炀显色，判定结果°（§）ABC-ELISA试验ABC-ELISA是淮.帝规ELISA原理的基础上，增加了生杨素（Biotin丿与亲和素（Avidin；问的放大作用。桌和素有4个亚单住组成，对生扬素有嵩度的桌合力。生杨素很易与蛋勺质共价结合。因此，结合了酶的亲和素与结合有抗体的生杨素发生反应即起到了多极放大作用。其操作步骤如下：a、己知抗凍的包彼及加待检McAb样％,同间接ELISA试验。b、加生杨素化抗亂Ig抗体，每孔lOOul,37°C1小时；冼涤。c,加酶栋桌和素，每孔1OOul,37°C30分钟洗涤；加底物显色，判定结果。⑦DoJELISA试验免疫斑点试殓CDot-ELISAj是以誚酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相戟体，进行抗原抗体反应的免疫检测手段。该法采用不嫁性底杨（如DAB,或4■氣棊酚或AgNO3等丿，其与柏应标记扬（HRP、AP、胶体全丿作用形成不涿性产物，呈现斑点状着色，从而易于判定结果。根据所用的标记扬不同，可分为HRP免疫斑点试验、AP免疫斑点试验和免疫全银斑点比等。其操作步骤大玫如下：a、将抗原液2・5ul点加于纤维素膜上，宝温37°C干燥。b、琦纤维膜浸入封闭液中，37T30分钟。c、用冼涤液洗2次，狹干后加待检McAb样％,37°C1小时；用洗涤液振荡冼涤三次，每■次5分钟，加HRP或AP或胶体金标记的抗亂Ig抗体，37°C作用30分钟。d、同法冼涤，唳干，用新配的相应底扬滚液显色，然后水洗终止反应，观秦结果。⑧免疫组化染色法该出主要用于检测针对细胞抗原成分的McAb,常用的方法是间接免疫过氧化物酶忒验仃IP,indirectimmunoperoxidaseJ及APAAP技术。其结果用光镜或倒置显微镜检查。（2）免疫熒光技术免疫熒光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原（包括细苗和动杨细胞丿、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作简单、斂感性嵩，可直接观察抗原定住等优点、,柱McAb的筛选与鉴走上具有重要的应用价值。®器材和试利a、供检测抗体用的抗原制备固定细胞片或板，活细胞悬液。b、PBSCPH7.2,0.01mol/L）c、待检的McAb样％。d,冷丙酌e、FITC（异硫氟酸炎光素丿或TRITC（四甲基异硫氟酸罗丹朗吳光素丿标记的抗亂Ig抗体等f、荧光显微镜，该力攪拌器，离心机，水浴箔等。②问接免疫吳光比a、固走细胞片的制备：生长柱盖片上的细胞（接种或未接种病毒丿，可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4°C丙酌固定10分钟，空毛干燥，置密封彖器于・20°C保存备用；单细胞悬液可柱盖片上制成涂片，固文方法同上。细胞涂片的制备：10ul细苗悬液（1X108个/ml丿涂抹7X21mm盖片上，自然干燥后，用-20°C丙齣固X10-15分钟，于・20°C保存备用。b、盖片雀去雳子水中湿润后置架上满加10-20U1杂交瘤上请或其他待检样％;设立阳性、阴性对照；置37°C水浴孵育0.5・1小时。c、取出盖片置PBS中用该力攪拌彖洗涤15分钟。d、盖片置架上，譎加工作浓度的抗亂Ig的熒光抗体10-20U1,37°C孵育0.5・1小时。e.同比洗涤15分钟；取出盖片，用延缓熒光碎天的封戟利（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS丿封于干净栽玻片上。f、光显微镜上观疼，阳性结果可见特异性吳光fFITC为黄绿色吳光，TRITC为桔红色吳光丿。g、细胞固定片的制备，也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上，柱观疼结果时，将培养板翻转置于熒光显微镜下，判断榇准不麦。③细胞的膜吳光染色完整的活细胞的细胞膜，抗体不能透过。如果细胞庇4°C操作，则吳光染色仅限于细胞膜。必、须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量吳光抗体，因此试验过程中要保证细胞的嵩活力。活细胞的膜熒光染色大致步骤如下：a、制备活性较好的细胞悬液，调节浓度至107个/mlob、柱小试管C5X50mm）中加入100ul细胞悬液，再加Zv100ul待检McAb的样器,混匀，4°C作用30・90分钟。c、用洗涤液（PBS900ml,小牛血请50ml,4%NaN350ml）洗二次，毎次加洗涤液1-5ml,lOOOr/min离心5分钟，弃上请。加入100ul吳光抗体，4°C作用30-90分钟。d、同法冼涤，将细胞重新悬于20-30U1含10%甘油和10-100ug苯二朕/ml的滚液中；譎加于我玻片上，加盖片封栽。e、立即在熒光显微镜上检查。f、细胞也可柱染色后用1%多聚甲醴生理盐水固定，立即检查，或至少屋4°C可保存一周。（3）问接血凝忒验间接血凝试验又称彼动血凝忒验（PHAJ,是目11应用较/•的检测方法之一。本试验是以包彼可嫁性抗原的红细胞作为指示糸统，当彼检抗体与包彼点红细胞上的抗原产生特异性反应时，导玫红细胞呈凝集现象。可见，该比具有灵敎、快速、彖易襟作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用議化红细胞以后，克服原来重复性差的缺点。①器材和试利a、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。b、缓冲液：PBS（PH7.2丿；醋酸缓冲液。c、甲議，丙酌醴，NaN3,抗凝利等。d,血凝板，振荡器等。②多無抗凍的间接血凝试验a、甲雄化绵羊红细胞的制备：无茵采集绵羊颈静脉血50ml,用枸椽酸钠作抗凝別；用5僖于红细胞压积的PH7.2PBSCNa2HPO4・12H2O3.58g,KH2PO40.4lg,NaCl8.01g,蒸馆水1000ml）充分洗涤5次，毎次1500r/min5・10分钟，直至上请测走无蛋勺质（用饱和硫酸銭满定上请，观疼有无自色沉淀丿，再以柏同缓冲液配成25%红细胞悬液；25%红细胞悬液与20%甲醴以2.5：1的比例混匀，37°C水浴作用2小时，毎15分钟振荡一次，红细胞颜色逐浙由鮮红色转变为棉色；以PH7.2PBS洗涤4次，每次2000r/min10分钟，再以同样的PBS制成25%红细胞悬液；其后，重复醴化一次，方法同前；最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲議至0.3%防庸，4°C保存备用。b、脂多無抗原玫斂甲議化绵羊红细胞的制备：取脂多無fLPSJ,0.2mol/LPH8.0PB液，调整多続浓度至120ug/ml,然后100°C水浴戏理1小时；将冷却至37°C的热处理LPS与6%愍化红细胞等量混合，37°C搅拌作用45分钟；取出离心2000r/min10分钟，以0.01mol/LPH7.2PBS洗涤■4次；配制成4%致敎血球，分裝，保存于4°C备用，或冻干保存。c、McAb的筛选：取待测McAb样％25ul,加入V型微量血凝板孔中，同时设立阴性、阳性对照；再加入0.5-4%玫斂红血球悬液25ul,柱振荡器上混匀30秒；置宝温或37T30-60分钟观疼结果。阴性对照孔应呈紧缩的0Ao③可嫁性蛋勺抗原的间接血凝试验a、红细胞議化：采用玖議也。采绵羊或人“O”型抗凝血，每次加10信于红细胞压积的PBS洗漆4・6次，然后配成8%红细胞悬液；向此8%红细胞悬液缓慢加入等量含有3%丙齣雄和3%甲議的PBS,于宝温缓慢搅拌17小时；其后洗涤3次，配成20%玖雄化红细胞悬液，加0.l%NaN3防庸，4°C保存备用。b、玫敎红细胞:取20%双醴化红细胞0.lml,1500r/min10分钟，弃上请，沉积红细胞加0.2mol/LPH4.0醋酸-醋酸钠缓冲浚lml,并加最适浓度（应预先测走，蛋仓抗原为50ug/ml左右）的抗原lml,混匀，于45°C致紋30分钟，有时轻轻搖动，使红细胞不下沉。然后离心去上请，并用20信于红细胞压积的PBS冼3・4次，最后用PBS配成0.5・1%致敛红细胞，4°C保存备用。c、McAb测定：同上法。（4丿放射免疫测定放鉗免疫测定是用放鉗性同住素榇记抗原或抗体，以检测柏应抗原或抗体的定量方法。柱筛选和鉴定单抗时常用抗原固扌目法，即用抗原包彼聚乙烯微板，借以松测样％中的McAb,其操作步骤如下：a、用碳酸盐缓冲液将抗原稀猝至适宜的浓度＜1-100ug/ml),譎加聚乙炜微板孔内，1OOul/孔t4°C过夜或37°C2小时。b、弃去抗原液，每'孔加lOOul含0.5-1%BSA的PBS,4°C1-2小时封闭。c、用BSA-PBS冼涤3次，每次3分钟。d、加待检样％,毎孔lOOul,设立阴性孔、阳性孔和空勺孔；37T1-2小时，同法冼涤。e、每孔加1251榇记的抗亂Ig抗体工作液1OOul,37T1-2小时，同法洗涤。f、用丫•射线月烁计数仪分别测定各孔放対性。通常要求样％孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底5僖和10僖。若以空勺孔的放射性为基准，凡样％孔与阴性孔放鉗性之比大于3的样烙走为阳性。时间：2021.03.06创作：欧阳道