甘露聚糖酶活力的测定1.甘露聚糖酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（SigmaG0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。2.测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。3.试剂与溶液除特殊
说明
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外，所用的试剂均为
分析
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纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1甘露糖溶液，c（CHO）为10.0mg/ml：6126称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。3.2乙酸溶液，c（CHCOOH）为0.1mol/L：3吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3乙酸钠溶液，c（CHCOONa）为0.1mol/L：3称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5乙酸——乙酸钠缓冲溶液，c（CHCOOH—CHCOONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：33称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。3.6甘露聚糖溶液：0.6%（w/v）称取甘露聚糖（SigmaG0753）0.60g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。3.7DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4仪器与设备4.1实验室用样品粉碎机或碾钵。4.2分样筛：孔径为0.25mm（60目）。4.3分析天平：感量0.001g。4.4pH计：精确至0.01。4.5磁力搅拌器：附加热功能。4.6电磁振荡器。4.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45m。4.8离心机：2000g以上。4.9恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。4.10秒表：每小时误差不超过5s。4.11分光光度计：能检测350—800nm的吸光度范围。4.12移掖器；精度为1l。5标准曲线的绘制吸取缓冲液（3.5）4.0ml，加入DNS试剂（3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用缓冲液（3.5）定容至100ml，配制成浓度为0.10—0.70mg/mlD-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂（3.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。6试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml，在4℃条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04—0.08u/ml之间）。液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）进行稀释、定容（稀释后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04—0.08u/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节、校正至5.5，然后再用缓冲溶液（3.5）做适当定容。7测定步骤吸取10.0ml甘露聚糖溶液（3.6），37℃平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6），37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A。B吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6）（已经过37℃平衡），电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂（3.7），电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A。E8.试样酶活力的计算（A-A）×[K+C]EBOX=×1000（1）DM×t式（1）中：X—试样稀释液中的甘露糖聚酶活力，u/ml；DA—酶反应液的吸光度；EA—酶空白样的吸光度；BK—标准曲线的斜率；C—标准曲线的截距；OM—甘露糖的分子量（180.2）；t—酶解反应时间，min；1000—转化因子，1mmol=1000mol。X值应在0.04—0.08u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再D进行分析测定。X=X·D（2）Df式（2）中：X—试样甘露聚糖酶的活力，u/g；D—试样的总稀释倍数。f酶活力的计算值保留三位有效数字。9重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
浙公网安备 33021202002483