蔗糖酶的制备和活力测定会计学1蔗糖酶的制备和活力测定酵母蔗糖酶的制备各级分酶溶液活性的测定（1）葡萄糖标准曲线的制备（2）蔗糖酶水解蔗糖后还原糖含量的测定3.各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定4.各级分蔗糖酶溶液比活力的计算实验内容第1页/共15页比色法测酶活性的原理酶活力单位（U）：在特定条件下反应1min,每产生1mmol底物所需要的酶量，或转化底物中1mmol的有关基团的酶量。实际应用是1ml酶液所产生底物的量定为1ml酶液的活力酶的比活力:每mg酶蛋白质所具有的酶活力在蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖,最适pH值为3.5-...
会计学1蔗糖酶的制备和活力测定酵母蔗糖酶的制备各级分酶溶液活性的测定（1）葡萄糖标准曲线的制备（2）蔗糖酶水解蔗糖后还原糖含量的测定3.各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定4.各级分蔗糖酶溶液比活力的计算实验内容第1页/共15页比色法测酶活性的原理酶活力单位（U）：在特定条件下反应1min,每产生1mmol底物所需要的酶量，或转化底物中1mmol的有关基团的酶量。实际应用是1ml酶液所产生底物的量定为1ml酶液的活力酶的比活力:每mg酶蛋白质所具有的酶活力在蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖,最适pH值为3.5-5.5。通过测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖酶的活力，同时测定蛋白含量，从而求得酶的比活力。第2页/共15页制备蔗糖酶(冰上操作！)研磨水抽提（级分I）机械破碎，提取水溶性蛋白成分（留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量，余做下一步）热抽提（级分II）：去除部分热变性蛋白杂质（留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量，余做下一步）乙醇抽提（级分III）：有机溶剂沉淀浓缩蔗糖酶等量分装在两个1.5ml的EP管中，4℃保存，做为下两次实验中的酶酶分离提纯的总目标是提高回收率及纯度，保持较高的酶比活力（低温操作）第3页/共15页研磨水抽提（级分I）将研钵放入冰中，预冷去离子水称10g酵母和约5g二氧化硅，放入研钵中缓慢加入预冷的去离子水30ml，每次加2ml，边加边研磨；研磨30分钟以上，直至酵母细胞大部分研碎将混合物转入两个离心管中，平衡，4度10000rpm离心15min用滴管将上清水相转入另一个清洁离心管中，再次离心15min上清转入量筒测体积，用1M乙酸调节pH值至5.0留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量（冰上），余做下一步第4页/共15页热抽提（级分II）将级分I水浴50度30分钟，不断轻摇此时可以开始做葡萄糖标准曲线冰浴迅速冷却3-5分钟，4度10000rpm离心15min将上清转入小烧杯，置于冰上留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量（冰上），余做下一步第5页/共15页乙醇抽提（级分III）向烧杯中的级分II加入等体积95%乙醇，搅拌，冰浴10min4度10000rpm离心15min弃去上清，倒置于抽纸上沥干，沉淀等量分装于两个1.5ml的EP管中，4℃保存，做为下两次实验中的酶（级分III）冰浴和离心的同时，可以开始做级分I和级分II的蛋白质含量测定，酶活测定第6页/共15页葡萄糖标准曲线的制备以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线管号试剂ml012345标准糖溶液5mM00.60.81.01.21.40.1M醋酸缓冲液2.01.41.21.00.80.60.1MNaOH溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水杨酸溶液0.50.50.50.50.50.5混匀，沸水浴5min，流水冷却3min第7页/共15页葡萄糖标准曲线的制备以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线管号试剂ml012345标准糖溶液2mg/ml00.20.40.60.81.00.1M醋酸缓冲液0.20.20.20.20.20.2H2O1.81.61.41.21.00.80.1MNaOH溶液2.52.52.52.52.52.5二硝基水杨酸溶液0.50.50.50.50.50.5混匀，沸水浴5min，流水冷却3min第8页/共15页酶活测定（注意保留原管酶液，以备**）以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的糖含量管号试剂ml测定管对照管级分I(3管)级分II（3管）级分I（3管）级分II（3管）10%蔗糖溶液0.60.60.1M醋酸缓冲液1.31.325℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水杨酸试剂0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混匀，沸水浴5min，流水冷却3min第9页/共15页酶活测定（注意保留原管酶液，以备**）以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的糖含量管号试剂ml测定管对照管级分I(3管)级分II（3管）级分I（3管）级分II（3管）300mM蔗糖溶液0.60.60.1M醋酸缓冲液0.20.2H2O1.11.125℃水浴3min酶（1:10,1:50，1:100）各0.125℃水浴5min0.1MNaOH溶液2.52.5二硝基水杨酸试剂0.50.5酶（1:10,1:50，1:100）各0.1混匀，沸水浴5min，流水冷却3min第10页/共15页蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法）参照蛋白质浓度标准曲线(预制)，计算出各级分蛋白质含量。y=0.0035xX代表溶液的浓度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值样品0.5ml+考马斯亮蓝染液5ml，室温5min，测OD595H2O级分I（1:10）级分I（1:50）级分I（1:100）级分II（1:10）级分II（1:50）级分II（1:100）样品：第11页/共15页实验结果1、葡萄糖浓度的标准曲线2、级分I和级分II中的蔗糖酶的活力（每1ml蔗糖酶溶液产生的还原糖量）3、级分I和级分II中蛋白质的含量（每1ml所含的mg）4、计算级分I和级分II蔗糖酶的比活力：蔗糖酶的活力1ml蛋白质的含量5、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶（分装两支1.5ml离心管中，4℃保存，备用）比活力=第12页/共15页思考题比活力的概念和酶纯化过程中测定比活力的含义。比较级分I和级分II的比活力，试分析级分II比活力高的原因。第13页/共15页第14页/共15页
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