微生物快速检测技术

8、微生物的快速检测常见微生物检测项目 常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数。 致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。 国家标准GB/T47891-40：食品卫生微生物学检验：菌落总数测定、大肠菌群计数、沙门氏菌检验、志贺氏菌检验、致泄大肠埃希氏菌检验、副溶血性弧菌检验、小肠结肠炎耶尔森氏菌检验、空肠弯曲菌检验、金黄色葡萄球菌检验、溶血性链球菌检验、肉毒梭菌及肉毒毒素检验、产气荚膜梭菌检验、蜡样芽孢杆菌检验、霉菌和酵母菌计数、常见产毒霉菌的鉴定、椰毒假单胞菌酵米面亚种检验、单核细胞增生李斯特氏菌检验、肠杆菌科噬菌体检验、大肠菌群快速测定、双歧杆菌检验、乳酸菌检验、大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验、阪崎肠杆菌检验等。政府检测机构为什么需要微生物快速检测？ 提高检测效率 节约人力资源成本 与国际接轨 国内外食品安全形势严峻，恶性事件不断发生。 欧洲“二噁英”、“疯牛病”（20世纪90年代） 日本大肠杆菌O157:H7中毒（1996） 中国SARS（2003）、东南亚国家禽流感（2004） 美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件（2006）日益严峻的食品安全局势的需要企业为什么需要微生物快速检测？ 市场销售环节要求快速出货。尤其是一些保质期较短的产品。 减少物流的压力，尽可能减少仓存，加快资金周转。 节约人力资源成本（外资企业尤其突出） 对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，快速检测方法尤其重要。可以快速检测原料及半成品的污染情况，以采取相应的措施控制最终产品的微生物超标情况。快速检测方法势在必行！！ 国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功。 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向。一、常规微生物快速检测技术现状 传统计数改良法：1、螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数2、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测。3、纸片法：培养基固定在载体上。省去制做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。4、其它：如Simplate即用胶,改良MPN产品。螺旋平板法DWS螺旋平板接种仪aColyte自动菌落计数仪螺旋平板原理平皿旋转接种针往外移动同时自动将样品稀释1000倍螺旋平板法的优缺点 优点：与传统方法相比，无需稀释3个梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。 缺点：检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时。需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。滤膜法 滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。 优点：灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。 缺点：需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。皿膜法—以纸片法为代表 优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落计数较方便。 缺点：不能节省检测时间。检测成本相对偏高。大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应的问题，金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目前仅细菌总数纸片有一些用户。 纸片法是目前被广泛接受的方法。国标餐具大肠菌群采用的就是纸片法。其它即用胶，MPN改良法Simplatecolilert主要用于水样或澄清样品的大肠菌群或大肠杆菌检测 SimPlateTMTPC法：基于食源性细菌的蛋白质有特异性酶类，TPC培养基内含有多种细菌酶类所对应的底物。检样被细菌污染时，只要具有一种酶的活性即能与底物作用生成4-甲基伞形酮，培养24h后，在紫外线照射下，发出蓝色荧光。 食源性细菌悬浮于TPC培养基表面，在分隔的小池内能迅速进行生化反应，若有检样颗粒亦无干扰；它不是由48h形成的菌落来计数，而是24h后在紫外灯照射下 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 培养皿内能发出蓝色荧光的阳性池数，进而由最大近似值(MPN)表查出细菌的MPN。阳性池数与MPN呈松泊分布。 固定底物技术酶底物法，需要coliert试剂 采用大肠菌群细菌能产生D-半乳糖苷酶分解ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生D-葡萄糖醛酸酶分解MUG（4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。只需24小时即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。二、常规微生物快速检测技术现状 快速检测微生物数量的新方法：1、ATP法：目前产品较多，如CHARM，Biotrace,…..等。2、电化学法：Sy-Lab公司Bactrac4300，Tempo,…3、颜色变化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。4、流式细胞技术及激光扫描技术5、其它：热量法，放射测量法表面洁净的检测方法 微生物学法：纸片、琼脂板、棉签拭子、海绵拭子 非微生物学法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白质,降解糖、NADP(辅酶II)，其它。ATP---三磷酸腺苷ATP来源于细菌酵母霉菌生物膜组织残留废弃物污染人的污染（一）ATP法1.人接触设备或器具2.设备或器具被污染3.清洗不正常4.非正常的敏感物污染5.微生物污染检测原理荧光素荧光素酶腺苷一磷酸氧合荧光素荧光ATP法两大用途1、用于食品、化妆品和药品企业对生产线和管道进行快速清洁程度检测。政府检测机构用ATP方法缺乏法律依据。ATP法与微生物数量没有必然的联系。2、改良后用于食品、化妆品的商业无菌检测或终产品检验。LUM－T清洁程度快速检测1)将水样在玻璃纤维过滤器上过滤以便富集微生物；2)用适当的溶解剂溶解细胞；3)用适当的萃取剂萃取ATP；4)将ATP的萃取液加到盛有萤光素、萤光素酶的试管中，并用光度计记录下所产生光的量，将此读数和ATP浓度标准曲线相比较，就可得到待测样品中ATP含量；用得到的ATP含量确定水样中细菌数量。LUM-T的独特优势 CHEF熟肉制品成熟度检验 MicroQ水中微生物污染程度检测 Cidelite杀虫剂残留初筛 Paslite牛奶巴氏消毒效果 Somalite体细胞计数 SL/MRLtest抗生素残留检测（连接ROSA　imager)CharmATP检测基于ATP原理的用于成品检测的微生物检测系统 Charm　LUM-96（用于UHT产品-高温瞬间灭菌） Biotrace Celsis（主要用于化妆品） Millipore公司的MicroScanCelsis和LUM-96保温2天，检测30分钟（96个样）ATP法检测成品的优缺点 优点：LUM-96通常用于进行商业无菌检测。可大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。 缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，客户通常怀疑假阴性的可能，特别是用ATP单个检测代替常规微生物和致病微生物检测，其风险是一定存在的。(如保温增菌时间不够，菌数未达到一定数量，取样量太小，由于培养基原因，目标致病菌未大量增菌等原因)Millipore公司最新推出的MicroStarMicroStar的原理及局限性 MicroStar快速微生物检测系统是结合了生物荧光、膜过滤及CCD荧光照相检测等技术的新型检测系统. 可过滤样品经膜过滤后，将菌截留在特殊的滤膜上，滤膜放置在培养基表面增菌后取出，加ATP释放剂，然后加荧光素和荧光素酶，显示的荧光信号在荧光显微镜或荧光检测器下观察并计数。MicroStar的优缺点 优点：缩短培养时间，提高灵敏度。适合于菌数较低的可过滤产品使用。 缺点：仪器较昂贵，运行成本也非常贵。不能用于检测未知的可能菌数较高的样品(不知稀释多少倍，因菌数必须稀释至80个左右)。整个检测时间还不够快，通常需16小时以上。（二）电化学方法(电导率法或电阻抗法) 奥地利Sylab公司的Bactrac4300和Biotrac4200 梅里埃公司的Bactometer和Tempo 英国Multhus公司(已倒闭) 英国DWS公司的Rabit ……外观比较Bactrac4300梅里埃的BactoMeterDWS公司的Rabit马色斯120世界上最好的电化学微生物快速检测产品Bactrac4300系统Sy-lab—Bactrac4300常规微生物项目快速检测技术MicroFoss(Biosys)微生物自动监测仪微生物生长导致培养基pH值发生变化，由光学检测器检测底部琼脂层的颜色变化，记录达到突变点的时间。Microfoss的特点 与阻抗法类似，可以实现快速检测。 缺点：需要购买原厂的预装培养基，应用范围受限制，成本高昂。因此在我国目前还没有用户。梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪基于微生物生成产生CO2的原理。CO2积累越多，底部的CO2传感器变黄，由LED发射一束光至底部，探头检测反射光的强度。光强度与微生物数量有一定关系。方法较新，用户还需要一个过程了解。流式细胞计数技术用于非过滤产品流式细胞:线性流体单细胞分析灵敏的检测头流式细胞术（FCM）是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术（三）流式细胞技术及激光扫描技术FOSS公司BactoScanFC牛奶中总菌数快速检测仪采用流式细胞原理。对微生物进行核酸染色，用流式细胞技术进行计数BactoScanFC的优缺点 优点：速度快(50-150样品/小时) 缺点：死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难保养。灵敏度不够高。 适合牛奶企业检测原奶中细菌总数。美国Chemunex公司微生物快速检测系统 美国Chemunex公司将流式细胞技术与活细胞荧光探针标记及激光扫描技术相结合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速检测仪。 其最大的特点是只检测活细胞数，速度极快，处理量大。与FOSS的BactoScanFC检测死活细胞都检测不同。 是目前国际上正在认可的生物荧光定量检测微生物数量的两种方法之一。另一种是Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP检测的产品。荧光酶标记原理 直接单细胞标记(包括孢子) 细胞无增菌要求 标记在90分钟内完成 直接对活细胞和酵母进行标记标记的细菌标记后的酵母标记后的霉菌ChemScanRDI三个简单的步骤2.标记3.激光扫描1.过滤检测步骤-TVC1.过滤2.标记3.激光扫描样品过滤预标记60min滤膜转移ChemScanRDI™仪器分析标记30minChemScanÒRDI主机激光扫描分析仪3分钟分析时间结果直接显示细胞个数LaserscanningMicroscopeConfirmationBactiflow适合实验室或研究用日处理量不大于40个样品D－Count适合实验室或生产现场使用日处理量大于40个样品的场合标记和检测原理EnzymeViabilitysubstrateFreefluorochromeMicro-organismDetectorDetectorLaserFlowCell细胞标记12minutes细胞计数1minute自动吸样 无需预处理 每批可做64个样，含阴性和阳性质控最小的人力要求全自动标记和过滤 加所有要求的标记试剂 控制温育时间和温度 去除大的颗粒(25µm尼龙网过滤)快速敏感的分析 每小时50个样品 直接按个/mL显示结果数据处理 区分微生物和颗粒的功能强大 产品应用范围广 增强灵敏度 直接显示细胞数 无需数据解释 直观易读 完整的数据追溯性 易于确证三种型号的差异√√哪些类型客户可以使用？ 大型食品、化妆品、药品企业，对快速检测速度及样品处理量要求高。 目前仪器非常贵，运作成本与免疫法相似。三、致病菌快速检测方法 显色培养基法：技术成熟，产品很多。 免疫学方法：产品最多，特异性和敏感性都很高，但有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有EIA（酶联免疫），ELISA（酶联免疫吸附试验），GLISA（夹心酶联免疫吸附法），荧光酶免、免疫磁分离等方法。市场上的产品多，如BioMeriux,Tecra,Neogen,Biocontrol,Matrix等。 分子生物学方法：以基因探针检测法和PCR法为主。 基因芯片：研究热点。致病微生物快速检测产品免疫磁分离法—Matrix公司的Pathatrix致病菌快速检测系统ELISA方法—澳洲TECRA公司的免疫捕获快速检测分子生物学方法(基因探针及PCR方法)GLISA---胶体金免疫层析致病菌快速检测条荧光酶免—Vidas系列产品(略)显色培养基–法国AES公司GLISA－胶体金免疫层析检测条 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 胶体金检测条在临床诊断中广泛使用。方法成熟，使用简便。 关键是制备单克隆抗体，然后与胶体金交联，在亲水纸层析条上固定。 胶体金微生物检测条在国内已经有不少产品，但用户并不多，主要是质量不稳定。 外来的胶体金微生物检测产品比较多。（一）免疫学方法常见的胶体金检测条举例大肠杆菌O157李斯特氏菌沙门氏菌胶体金检测条的优缺点 胶体金检测方法属于免疫检测法，检测的是死菌和活菌。 一般需要增菌过夜。 增菌后的检测非常简单，约10分钟一般能完成。 无需专门的检测仪器。 进口的检测条的价格比较高，通常要30－90元。（二）分子生物学方法 基因探针法及PCR方法在国外已经有相当成熟的表现。 有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。 基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。 PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。分子生物学方法应用前景 试剂盒开发相对比较容易。只要找出特征的基因片断，合成出引物即可。 目前客户比较关注的致病菌，包括沙门氏、李斯特氏、大肠杆菌O157、副溶血弧菌、霍乱弧菌、志贺氏菌等均有PCR试剂盒供应。常见的基因探针方法或仪器 BAX Gene-trak Gen-probe Vermicon ……分子生物学方法病原菌检测系统的优缺点 分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。 但国外用户反映其假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。 速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出结果，与免疫法比没有速度优势 目前不少产品已经通过AOAC的认证。（三）显色培养基技术 用显色培养基鉴定微生物是一种新的微生物快速检测技术。该技术以生化反应为基础,通过在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物直接根据菌落颜色对菌种作出鉴定。常见食源性致病菌检测中,李斯特菌显色培养基(BCMTMListeriamonocytogenes,Rapid’LMONOagar,CHROMagarTMListeria)、大肠杆菌显色培养基(CHROMagarTMEcoli)、沙门氏菌显色培养基(Rambachagar)、金黄色葡萄球菌显色培养基(CHROMagarStaphylococcusaureus)等已被广泛应用于食品、医药和环境监测等领域,极大提高了微生物检测的效率。但是,显色培养基也存在一些假阳(阴)性等问题,其设计尚待优化。大肠杆菌显色培养基 利用大肠杆菌(Escherichiacoli)特异性酶检测鉴定大肠杆菌已十分普遍,大约96%～98%的大肠杆菌产生β2D2葡萄糖苷酸酶(β2D2Gud),绝大部分沙门氏菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌不能产生Gud,因此利用Gud酶底物可以有效的检测大肠杆菌。 目前开发的显色培养基常用酶底物有:52溴242氯232吲哚2β2D2葡萄糖苷酸(X2Gluc)、邻硝基酚β2D葡萄糖苷酸(PNPG),底物被Gud水解后产生显色物质使菌落呈现特殊的蓝色或黄色。法国科玛嘉CHROMagarEcoli是目前应用较广泛的大肠杆菌显色培养基,在这种培养基培养24h后,大肠杆菌呈现蓝色菌落。沙门氏菌显色培养基 沙门氏菌(Salmonellaspp.)也是一类重要的食源性致病菌,常规分离鉴定需要非选择性预增菌、选择增菌、选择分离平板鉴定等步骤,操作十分繁琐。 德国Merck公司生产的显色培养基Rambachagar以丙烯乙二醇和52溴242氯232吲哚2β2D半乳糖吡喃糖苷酸(X2GAL)为底物检测沙门氏菌,沙门氏菌能水解乙二醇产酸,不能水解X2GAL,在培养基上产生特殊的红色菌落。临床检测结果表明其效果明显优于传统培养基BS、SS,且假阳性率较低。金黄色葡萄球菌显色培养基 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)也是重要的食源性致病菌,DNA酶和凝固酶是其重要的标志酶。以甲苯胺蓝、甲基绿、丫啶橙和52溴242氯232吲哚2胸苷232磷酸等为显色底物(如CHROMagarStaphylococcusaureus)或以D2phe2pro2arg2β奈胺为底物都能有效检测鉴定金黄色葡萄球菌。法国CHROMagar公司和瑞士Fluck公司都已研制出检测该菌的显色培养基并广泛应用于食品卫生行业。李斯特菌显色培养基 李斯特菌(Listeriaspp.)是一类个体较小的革兰氏阳性杆菌,包括7个种,其中只有单增李斯特菌(L.1monocytogens)和绵羊李斯特菌(L.1ivnovii)具有致病性。绵羊李斯特菌是动物致病菌,被列为90年代4大致病菌之一,是食品卫生行业的常检致病微生物。近年来,许多国家致力于李斯特菌显色培养基的研究,针对李斯特菌特有的肌醇磷酸磷脂酶(PI2PLC)和β2D2葡萄糖苷酶(β2D2glucosidase)设计显色底物对李斯特菌进行快速检测。微生物菌落颜色单增李斯特氏菌绿色菌落，周围有晕圈绵阳李斯特氏菌绿色菌落，周围有晕圈英诺克李特氏菌绿色菌落其他显色培养基 大肠杆菌O157:H7显色培养基微生物菌落颜色大肠杆菌O157:H7紫红色其他大肠杆菌蓝色其他无色或被抑制阪崎肠杆菌显色培养基微生物菌落颜色阪崎肠杆菌蓝绿色大肠菌群无色菌落金黄色葡萄球菌被抑制弧菌显色培养基微生物菌落颜色副溶血性弧菌紫红色霍乱弧菌蓝绿色拟态弧菌蓝绿色