Potyvirus属成员基因组全序列的简并引物PCR和RACE扩增方法

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net Potyvirus 属成员基因组全序列的简并 引物 PCR和 RACE扩增 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 陈炯 ,陈剑平 (浙江省农业科学院病毒室 ,浙江 　杭州 　310021) 关键词 :马铃薯 Y病毒属 ;简并引物 ;全序列测定 中图分类号 :S432141 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :1000 - 8721 (2002) 04 - 0371 - 04 　　马铃薯 Y病毒属 (genus Potyvirus) 是已确定的 植物病毒属中最大的一类 , 有约 200 个种类被 ICTV 接受为确定成员或可能成员 ,占已发现的植 物病毒总数的 20 % ,且新成员数量仍在不断增加 , 是种类最多、寄主范围最广、经济意义最大的病毒 属。该属成员单链正性 RNA 基因组长度一般在 10 000个核苷酸左右 ,3′- 末端具有 poly (A) 尾 ,含 单一的大开放读码框 ,先 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 成多聚蛋白 ,随后自催 化裂解为 10 个成熟产物。该属成员基因组全序列 的克隆方法通常采用双链 cDNA 克隆 ,但由于基因 组较长 ,近全长克隆效率很低。近年来 ,根据生物信 息学原理 , 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 登录的植物病毒核苷酸序列来设计 简并引物 ,扩增未知序列的方法已有不少报道 ,但研 究多限于病毒基因组 3′- 末端区域序列[1 ,2 ] 。本文 通过分析设计 Potyvirus 属简并引物 ,初步建立了该 属未知成员基因组全序列的 PCR 和 RACE 技术快 速扩增方法。 对已知全序列的 Potyvirus 属成员编码的多聚 蛋白氨基酸序列作多重序列分析后 ,根据保守氨基 酸序列 ,设计并筛选出 5 个属特异性 PCR 简并引物 ( 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1) 。 表 1 　用于扩增 Potyvirus 属成员基因组全序列的简并引物和 RACE引物 Table 1 　Primers for degenerated PCR amplification and RACE of the cDNA sequence of genomic RNA of genus Potyvirus Primer Positiona Nucleotide sequence (5′- 3′) b Tmc ZHM1d - CTC TTC CCC TCC CTC CTC ZHM2 - GAG GAG GGA GGG GAA GAG 60 p HC( + ) e 1911 - 1927 TGY GA Y AA Y CAZ TTX GA 42 - 52 pCI1 ( + ) e 4149 - 4168 GTX GGX TCX GGX AAX TCX AC 54 - 64 pCI2 ( + ) e 4800 - 4819 GCX ACX AAX ATX ATX GAX AA 48 - 60 pNIa ( + ) e 6936 - 6952 TN Y TGG AAM CA Y TGG AT 44 - 50 Sprimere 8169 - 8188 GGX AA Y AA Y AGY GGX CAZ CC 56 - 68 M4 - GTT TTC CCA GTC ACG AC 52 　　aAccording to the positions in complete sequence of DsMV - M13 ( EMBL/ DDBJ/ GenBank accession number :AJ298033) ; 　bX = A , T ,C or G , Y = T or C ,Z = A or G ,N = A or T ,M = A , T or G ,with the identical ratios of degenerated nucleotides ; 　cTm = (A + T) x2 + ( G + C) x4 ; 　d5’- termi2 nus phosphorylation and 3’- terminus amination ; 　eDegenerated primers of genus Potyvirus1 收稿日期 :2002 - 06 - 12 ;修回日期 :2002 - 07 - 14 基金项目 :浙江省青年科技人才专项 ( RC9604) ;浙江省重点实 验室专项 (001107557) ;浙江省十五重点科技项目 (011102181) 作者简介 :陈炯 (1975 - ) ,男 ,浙江绍兴人 ,研究员 ,博士 ,从事线 状植物病毒种类分子鉴定和基因组学研究。 联系作者 :陈剑平 , Tel : (0571) 86404003 ,E - mail :jpchen 2001 @ hzcnc1com　　以植物总 RNA 或提纯的病毒 RNA 为模板 ,M4 - T[ 5′- GTTTTCCCA GTCACGAC ( T) 15 - 3′]为起始引物 ,M - MuLV 逆转录酶 ( Gibco 公司)合成 第一链 cDNA。用简并引物 Sprimer 结合 M4 引物扩增病毒 RNA 基因组 3′- 末端序列 (图 1) 。PCR扩增体系采用 Expand LongTM Template PCR Sys2tem(Roche 公司) ,反应程序一般为 94 ℃变性 2min后 ,按以下流程做 30 个循环 ,每一循环包括 94 ℃变性 015min ,退火 (根据 Tm 值确定) 015min ,68 ℃合成 2min。循环结束后 68 ℃延伸反应 10min ,以确保获得全长产物。Potyvirus 属已知成员该区段扩增产物大小一般在 117kb 左右 ,但大葱黄条病毒 (leekyellow stripe virus ,L YSV)由于 3′- U TR 较长 ,预期 第 18 卷 　第 4 期 2 0 0 2 年 1 2 月 　　　　　　　　　　　　 病　　毒　　学　　报 CHINESE JOURNAL OF VIROLO GY 　　　　　　　　　　　　 Vol. 18 　　No. 4 　Dec. 　　2 0 0 2 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 图 1 　Potyvirus 属成员基因组全序列简并引物扩增及 RACE示意图 Figure 1 　Strategy of degenerated PCR amplification and RACE of complete genome sequence of genus Potyvirus Specific primers were designed according to the gained viral sequences , ( + ) means same to the viral sequence , ( - ) means complementary to the viral se2 quence1 ·273· 病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　18 卷 　 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 片段为 2kb (表 1) 。然后根据已获得的病毒 3′- 末 端序列信息设计特异性引物重新合成第一链 cD2 NA。简并 PCR 反应程序同前 ,引物配对如图 1 所 示。 基因组 RNA 5′- 末端序列扩增方法采用 5′- RACE 技术。首先根据已获得的病毒序列设计特异 性下游引物 ,起始合成病毒 RNA 5′- 末端序列的第 一链 cDNA。第一链 cDNA/ RNA 杂合体用 Q I2 Aquick 胶纯化试剂盒 ( Qiagen 公司 ) 纯化后 , 在 100 ℃变性 2min ,立即冰浴冷却。随后将连接引物 ZHM1 用 T4RNA 连接酶以 5′- 磷酸连接到单链 cDNA 3′- 末端的羟基上 ,50μl 反应体系包括 14μl 变性的 cDNA/ RNA 杂合体 , 2μl 连接产物 ZHM1 (011nmol/ L) ,3μl 011 % BSA ,5μl 10 ×T4RNA 连接 酶反应缓冲液 , 1μl T4RNA 连接酶 , 25μl 50 % PEG8000 。混匀后在 37 ℃反应 30min ,用 Q IAquick 胶抽提试剂盒纯化 cDNA - ZHM1 形式的连接产 物。以其为模板 ,ZHM2 和病毒特异引物结合做半 套式 PCR 扩增 cDNA 3′- 末端序列 (对应于病毒基 因组 RNA 5′- 末端序列) ,简并 PCR 反应程序同前 (图 1) 。 常规的 mRNA 3′- 末端序列扩增技术通常采 用寡聚 T 引物 (15～18 个) 合成第一链 cDNA ,并且 该引物也用作后续 PCR 扩增 ,但由于退火温度太 低 ,特异性扩增比较困难。本文描述的方法能使得 病毒第一链 cDNA 的 5′- 末端携带 M4 特异引物 , 对于提高退火温度 ,降低非特异性扩增有较好的作 用 ,该 3′- 末端序列扩增方法已成功用于 30 多个 Potyvirus 属成员的检测[3 ] 。 Potyvirus 属成员 RNA 5′- U TR 末端区域序列 ( Poty 盒)比较保守 ,可以用来设计引物 ,但这种方 法一方面将无法获得病毒基因组 RNA 最末端的准 确信息 ,另一方面也极可能因为引物和实际序列的 差异而导致 PCR 不工作 ,因此该区端序列测定通常 采用 RACE 扩增。自报道以来 , 许多实验室对 RACE 方法作了改进以满足不同的要求。经典的 5′ - RACE 用末端转移酶在目的 RNA 的 5′- 端 ,也就 是第一链 cDNA 的 3′- 端加 poly (A) ,但效率不高。 新的 5′- RACE 方法先用 T4RNA 聚合酶在目的 RNA 的 5′- 末端加上一个 RNA 寡聚引物 ,然后以 此序列互补引物起始逆转录合成第一链 cDNA。而 本文改进方法除第一步合成第一链 cDNA 外 ,其余 操作对象均为 DNA ,连接引物也为 DNA ,花费少且 简便实用 ,该方法已成功用于其它属植物病毒的末 端序列测定[4 ,5 ] 。从测序结果来看 ,用提纯的病毒 RNA 作模板 ,该方法全长末端克隆比率一般大于 60 % ,且扩增片段长度在 115kb 以上 ,对于病毒中间 未知区域序列的扩增也适用。 应用本方法已成功扩增了 5 个基因组全序列未 知 Potyvirus 属的病毒的基因组全序列 :芋花叶病毒 (dasheen mosaic virus ,DsMV) 、L YSV、甘蔗花叶病 毒 ( sugarcane mosaic virus , SCMV) 、高粱花叶病毒 (sorghum mosaic virus , SrMV) 和薤花叶病毒 ( scal2 lion mosaic virus ,ScaMV) ,并明确 ScaMV 为该属的 一个新成员[6 ,7 ,8 ] 。证明此方法对 Potyvirus 属成员 分子鉴定、分类及基因组学研究均具有参考价值。 参考文献 : [1 ] Gibbs A , Mackenzie A1A primer pair for amplifying part of the genome of all potyvirus by RT - PCR [J ] 1Journal of Virological Methods ,1997 ,63 :9 - 161 [ 2 ] Okuda M , Hanada K1RT - PCR for detecting five distinct Tospovirus species using degenerated primers and dsRNA template [J ]1Journal of Virological Methods ,2001 ,96 (2) :149 - 1561 [3 ] Chen J , Chen J P ,Adams M J1A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several members of the family [J ] 1Archives of Virology , 2001 ,146 (4) :757 - 7661 [4 ] Zhang H M , Chen J P , Adams M J1Molecular characterization of segments 1 to 6 of Rice black - streaked dwarf virus from China provides the complete genome[J ]1Archives of Virology ,2001 ,146 (12) :2331 - 23391 [ 5 ] Diao A P ,Chen J P , Gitton F1Sequences of European wheat mosaic virus and oat golden stripe virus and genome analysis of the genus furovirus[J ]1Virology ,1999 ,261 (2) :331 - 3391 [6 ] Chen J ,Chen J P ,Chen J S ,et al1Molecular characterization of an isolate of Dasheen mosaic virus from Zantedeschia aethiopica in China and comparisons in the genus Potyvirus[J ]1Archives of Vi2 rology ,2001 ,146 (9) :1821 - 18291 [ 7 ] Chen J ,Chen J P ,Adams M J1Characterization of potyviruses from sugarcane and maize in China [J ]1Archives of Virology ,2002 ,147 (6) :1237 - 12461 [8 ] Chen J ,Zheng H Y ,Chen J P1et al1Characterization of a potyvirus and a potexvirus from Chinese scallion [J ] 1Archives of Virology , 2002 ,147 (4) :683 - 6931 ·373·　4 期 　　　　　　陈炯等 : Potyvirus 属成员基因组全序列的简并引物 PCR 和 RACE扩增方法 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net Determination of Genome Sequence of Potyviruses by Degenerated PCR and RACE Methods CHEN Jiong ,CHEN Jian - ping ( V i rology Depart ment , Zhejiang Academy of A gricult ural Sciences , Hangz hou 　310021 , China) Abstract :Based on multi - alignment of complete polyprotein amino acid sequences of genus Potyvirus ,five de2 generated primers were designed1They were Sprimer (5′- GGX AA Y AA Y A GY GGX CAZ CC - 3′) ,pN Ia ( + ) (5′- TN Y TGG AAM CA Y TGG A T - 3′) ,pCI2 ( + ) (5′- GCX ACX AAX A TX A TX GAX AA - 3′) , pCI1 ( + ) (5′- GTX GGX TCX GGX AAX TCX AC - 3′) and p HC( + ) (5′- TGY GA Y AA Y CAZ TTX GA - 3′) (X = A , T ,C or G: Y = T or C ;Z = A or G;N = A or T ;M = A , T or G) 1Using degenerated PCR and modi2 fied RACE methods ,a protocol for determination of complete genome sequence of potyviruses was established and proved to be successful on five potyviruses1 Key words :genus Potyvirus ;degenerated primer ;determination of genome sequence ·473· 病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　18 卷