辣根过氧化物酶／聚乙烯醇缩丁醛／碳纳米管修饰玻碳电极检测过氧化氢

· 30 · 贵州工业职业技术学院学报 Journal of Guizhou Industry Polytechnic College 2 0 1 1年 6月 第6卷第2期 辣根过氧化物酶／聚乙烯醇缩丁醛／碳纳米管 修饰玻碳电极检测过氧化氢 木 韩莉 陶菡 张义明1,2 (1．贵州大学发酵 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 与生物制药省重点实验室，贵州 贵阳，550003； 2．贵州工业职业技术学院，贵州 贵阳，550008) 摘 要 制备了辣根过氧化物酶／聚乙烯醇缩丁醛／碳纳米管修饰玻碳电极的过氧化氢生物传 感器。以对苯二酚为电子媒介，采用循环伏安法和电流时间法考察 了该传感器对 H 0 的催化性 能。讨论了媒介体浓度、工作电位、温度、PH对电极响应的影响。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明传感器对H：0 表现出 良好的电催化性能。在 PH=7．0，对苯二酚浓度4．2 mmol／L，工作电位 一250mV的实验条件下， H202浓度在1．67×10一 ～I．29×10 moI／L及1．58×10～～1．17×10 moL／L范围内与传感器的 电流响应呈线性关系，检出限(S／N=3)为5．554×10一moL／L。该传感器制备 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 简单，成本低，稳 定性好，对H 0 有快速灵敏的响应。 关键词 辣根过氧化物酶 碳纳米管 聚乙烯醇缩丁醛 过氧化氢 中图分类号 TS207．3 文献标识码 A 文章编号 0000一SKl49(2011)92—0030—04 Carbon nanotube／polyvinyl butyral／horseradish peroxidase modified glassy carbon electrode for determination of hydrogen peroxide HAN Li，TAO Han，ZHANG Yiming (1．Province Key Laboratory ofFermentation Engineering and Biopharmaceutical，Guizhou University， Cuiyang 550003；2．Guizhou Industry Polytechnic College，Guiyang 550008) Abstract：A hydrogen peroxide biosensor has been made by Horseradish Peroxidase(HRP)一polyvi— nyl butyral(PVB)一muhi—wall carbon nanotube(MWNT)immobilizing on the glassy carbon electrode surface．Using hydro—quinone as nediator，the electsocatalytic properties of this sensor toward Hydrogen Peroxide were observed by cyclic vohammetry method and i—t Curves．The effect of working potential，pH， temperature and concentration of hydroquinone were discussed in detail．The experimental results indicated that the sensor possessed hi gh catalytic activity．In the best conditions，pH 7．0，4．2mmoI／L hydroquinone， 一 250mV working potentia1．the linear range was1．667×10一 一1．286×10一 and 1．582×10一 一1．173 ×10一 with a detection limit of5．554×10一 moI／L．Additionally，The biosensor is easy—making，low cost and has excellent stability and high sensitivity． Key words：horseradish peroxidase；carbon nanotube；polyvinyl butyarl；hydrogen peroxide ·基金项目 省科学技术基金项目(黔科合J字E2008]2093号)。 作者简介 ． 韩莉(1983一)，女，硕士研究生，研究方向为电化学生物传感器。 过氧化氢(H 0 )具有良好的消毒、杀菌和漂 白作用。在食品行业，H 0 作为生产加工助剂应 用于乳品、饮料、水产品、瓜果及啤酒等生产过程 中⋯。但H 0 超标使用会对人体健康产生不良 2 第 0 6 1 卷 1- 第 ~ 2 6 期 Pl 韩莉 ，等：辣根过氧化物酶／聚乙烯醇缩丁醛／碳譬米管修饰玻碳电极检测过氧化氢 ．31． 影响 J。国家卫生标准中明确规定，在食物加’工 过程中H 0 的使用量不应超过限制量。但近年 来，食品中残留的H 0 引起的食物中毒事件仍时 有发生。因此，构建灵敏、简单的 H：0 检测方法， 对于食品中H 0 含量的有效监控具有重要意义。 目前，检测 H 0：的方法主要有滴定法 j、分 光光度法 引、光谱法 、化学发光法 们、色谱法 、 电化学法 等。相比其它方法，电化学法具有灵 敏、快速、简单等优点。其 中，以辣根过氧化酶 (HRP)修饰的H 0 电化学传感器由于具有构造 简单，选择性好，灵敏度高等特点，近年来得到了 迅速发展。 碳纳米管(MWNT)具有比表面积大、吸附能 力强以及良好的生物相容性等特点，可以增强酶 的吸附量并保持其生物活性。聚乙烯醇缩丁醛 (PVB)以其良好的成膜性已多次被应用于生物传 感器。但将碳纳米管与聚乙烯醇缩丁醛作为复合 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 用于生物传感器还未见报道。本研究以碳纳 米管和聚乙烯醇缩丁醛作为复合固酶基质，以对 苯二酚为电子媒介体，制备了过氧化氢生物传感 器。实验结果表明，该传感器具有线性范围宽，灵 敏度高，使用寿命长等特点。 1 试验部分 1．1 仪器与试剂 CH1600C电化学工作站(上海辰华仪器公 司)；工作电极为修饰玻碳电极；铂电极为对电极； 参比电极为 AS／ASC1(3mol／LKC1)电极。 辣根过氧化物酶(HRP，EC．1．11．1．7，250U／ ms)购自国药集团化学试剂有限公司)；多壁碳纳 米管(MWNTs)购自深圳纳米港公司，并在 2．6mol · L～HNO 中回流 10 h；聚乙烯醇缩丁醛(PVB) 购自上海楷洋生物技术有限公司；其他试剂均为 分析纯；试验用水均为二次蒸馏水。 1．2 酶电极的制备 玻碳电极(GCE)依次用0．3p,m和0．05I~m的 AI 0，粉末抛光后，依次在乙醇和纯水中超声清洗 后氮气吹干备用。将30t~L0．1m~mL MWNT悬液 和 251xL 2．5mg／In LHRP溶液混合，1h后取 0． 3mL15ms／m LPVB无水乙醇溶液于混合液中并搅 拌均匀。取51xL混合液滴加到玻碳电极上，室温 晾干，制得 HRP／PVB／MwNT修饰电极。制得的 电极不用时置于PBS中4℃保存。 1．3 检测方法 将修饰电极置于 6mL0．1mol／LPBS(pH7．0) +4．2mmol／L对苯二酚的溶液中，待背景电流稳 定后加入不同浓度的 H：0 ，工作电位为 一250mV 时，以i—t曲线记录其稳态还原电流。所有的测 量均在室温(约 25~(2)下进行。测试前向溶液中 通氮气 10 min，以除去溶液中的溶解氧。 2 结果与讨论 2．1 重电极在不同修饰过程中的电化学行为 图 1比较了不同修饰电极对 H 0 的电流时 间响应。由图可知，MWNT／PVB电极对 H O 基 本没有响应；用 PVB直接固定的HRP具有生物活 性且对H O 有响应，但响应较小，原因是吸附在 电极表面的辣根过氧化物酶少且不稳定；而加了 MWNT的修饰电极对H：O 的电流响应明显增大， 原因是MWNT可以促进 HRP与电极问的电子传 递。此外，酸活化的 MWNT带负电，具有高比表 面积的带负电荷的 MWNT和表面带正电荷的 HRP可通过静电吸附作用有效地防止酶从膜中泄 漏，同时也保持了酶的活性 】，有利于提高检测的 灵敏度。 图1 不同电极对H2O2的电流时间响应 在2O一250mV／s采用循环伏安法考察了峰电 流值与扫描速率的关系。峰电流与扫描速度的平 方根呈良好的线性关系，表明酶电极的电化学过 · 32· 贵州工业职业技术学院学报 Journal of Guizhou Industry Polytechnic College 2 0 1 1年 6月 第6卷第2期 程是受扩散控制的。 2．2 试验条件的优化 2．2．1 对苯二酚浓度的影响 对苯二酚浓度对酶电极催化氧化 H：0 有很 大的影响。对苯二酚浓度过低时，不足以传递酶 反应过程中得失的电子 。。，所以电极的电流响应 值较低。随对苯二酚浓度增大，电极的响应值也 增加，当对苯二酚浓度为4．2mmoL／L时，电流响 应值达到最大。因此选择对苯二酚的浓度为 4． 2mmoL／L。 2．2．2 工作电位对酶电极响应的影响 实验考察了工作电位对酶电极响应的影响。 随着工作电位从 一50mY下降到 一250mV，还原电 流逐渐增大，至一250mV之后又呈减小趋势，说明 工作电位越负，酶修饰电极的灵敏度越大；但在过 负的电位下基线电流高，电流不稳定，溶液中其它 电活性物质容易在电极上发生还原反应，给测定 带来干扰。故试验选择工作电位 一250mV。 2．2．3 温度和pH的影响 在 15—45℃范围内考察了温度对酶电极响应 的影响。随温度升高，催化电流增大。虽然温度 升高可以使酶催化反应速度增加，但过高的温度 会使酶蛋白变性而失活，影响酶电极的使用寿命。 故选择在室温25℃下进行试验。 在 pH4．5—9．0的PBS缓冲溶液中，考察了酶 电极对1．0 X 10一moL／L H 02的响应。试验发现： 随着 pH值的增大，电极的响应电流随之增大，当 达到7．0之后，响应电流又随之减小。因此，实验 选用 pH7．0的PBS为支持电解质。 2．3 酶传感器性能测定 图2为在优化的试验条件下，用电流时间法 测定 H ．／PvB／MWNT／GCE修饰电极对 H：0 的 响应电流和校正曲线。试验结果表明，响应电流 与H202浓度在 1．67 X 10～一1．29 X 10 mol／L 及 1．58 X 10一一1．17×10 mol／L范围内各存在 一 个线性关系。在 1．67×10一 一1．29 X 10 mol／ L范围内，线性回归方程为 I( A)=一34．38c一 0．35，相关系数 为 0．9982；在 1．58 X 10～ 一 1．17 X 10 mol／L范 围 内，线 性 回 归 方 程 为 I( A)=一15．08c一1．19，相关系数为 0．9979。 检出限为5．55 X 10 mol／L(S／N=3)。 2．4 传感器的重现性、稳定性及抗干扰性 用0．1mmol／I_,H O 考察了传感器的重现性及 稳定性。用同一支电极对 H 0 重复测定 8次，相 对标准偏差为 3．02％。当酶电极不使用时置于 PBS中4℃保存。5d后，该生物传感器的响应下 降约4．3％；20d后‘，该生物传感响应下降约20％； 50d后，传感器的响应下降为最初的50％，说明该 生物传感器具有较好的稳定性。 图2 H即 ／PVB／MwNT／G 修饰电极对连续加入 0．1 mmo~L H 0 的电流 一时间曲线 插 图：标 准 曲线底 液：6mL 0．1moVLPBS (pH7．O)+4．2mmol／L对苯二酚溶液；工作电位： — ． 250mV 考察了6种物质对 H 0 传感器的干扰情况。 当溶液中H 0：浓度为0．1mmoL／L时，20倍 的葡萄糖、乙醇、乙酸．、柠檬酸、甘氨酸均无明显干 扰，5倍的抗坏血酸存在一定的干扰。 3 结论 本文以聚乙烯醇缩丁醛为固酶基质，将多壁 碳纳米管与辣根过氧化物酶固定在电极表面制备 了一种响应灵敏度高、稳定性好的过氧化氢生物 传感器。该传感器固定酶的方法简单，易行，有较 好的电流响应和较低的检测下限，是一种可行的 过氧化氢测定方法。 参考文献 [1] 林倩，张菊，王晓芳，等．食品级过氧化氢的应用及其净 2 第 0 6 1 卷 1- 第 ~F- 2 6 期 ~ 韩莉 ，等：辣根过氧化物酶／聚乙烯醇缩丁醛／碳纳米管修饰玻碳电极检测过氧化氢 ． 33． 化技术【J J．食品科学，2006，27(10)：626—629． [2] 扛国虹，杨溢，白世基，等．一起过氧化氢污染学生奶事 件 的调查报告[J]．中华预防医学杂志，2003，37(5)： 391． [3] 潘勇军，谢洪泉，谭晓明，等．碘量滴定法测定过氧化氢 溶液浓度的改进[J]．理化检验一化学分册，2003．39 (7)：_4o4—405． [4] 陈亚红，刘红梅，田丰收，等．醇催化分光光度法测定过 氧化氢[门．理化检验一化学分册，2009，45(4)：401— 40 3． [5] Matsubara C，Kawamoto N，Tdgmura K．Uhm—high semi- tivity speetrophotometdc reagent for hydrogen pemxide [J]．Ana—lyst，1992，117：1781—1786． [6] Nakashima K，Maki K，Kawquchi s，et a1．Super—Dyn锄- ic—-Range Measurement of Fr——IR Speetra by Delta-— 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