chapt07RNA的转录合成

null分子生物学教程分子生物学教程赵亚华编著科学出版社2011年7月第三版第1章 绪论 Introduction 普通高等教育“十一五”国家级规划教材7.1 RNA转录概述 General introduction of Transcription8-*转录( transcription):在DNA依赖的RNA聚合酶作用下，从双链DNA合成单链RNA的过程称之为转录。 转录单位：RNA链的转录起始于DNA模板的一个特定起点，并在特定的终点终止，此转录区域被称为转录单位。 RNA合成的模板是反义链； 必需的成分：启动子/ RNA聚合酶/4NTPs /终止子7.1 RNA转录概述 General introduction of Transcriptionnull8-*1）转录具有选择性； 2）RNA链的转录起始和终止于DNA上特定的部位； 3）催化反转录的酶是依赖DNA的RNA聚合酶； 4）被转录的DNA双链中有一条参与转录； 5）转录的起始由DNA分子上的启动子控制； 6）合成RNA的底物是ATP,GTP,CTP和UTP； 7）新合成的RNA是以5’→3’方向延伸。8.1.1 RNA转录的一般特点null8-*转录泡 Transcription bubblenull8-*DNA 双螺旋5’-CGCTATAGCGTTTGCAGGCGTTCACGGC-3’ 3’-GCGATATCGCAAACGTCCGCAAGTGCCG-5’mRNA （RNA transcript） 5’-CGCUAUAGCGUUUGCAGGCGUUCACGGC-3’ 转录DNA 非模板链（编码链）, （+）正链 或正义链）模板链,负链（-）或反义链7.1.2 原核与真核基因转录的差异8-*7.1.2 原核与真核基因转录的差异1）只有一种RNA聚合酶参与原核基因的转录，真核生物有3种以上的RNA聚合酶负责不同类型的基因转录。 2）转录产物差别很大，以多顺反子形式存在，真核转录产物是以单顺反子形式存在成熟的mRNA只占初始转录产物的一小部分。 3）真核的转录产物需要经过剪接，加工成熟，而原核转录产物几乎不需要加工。null8-*4）原核转录产物为多顺反子，大多数真核生物的mRNA是单顺反子； 5）在原核生物细胞中，转录产物可以直接作为蛋白质合成的模板，转录mRNA与蛋白质的翻译相互偶联。真核生物细胞的转录是在细胞核进行的成熟后通过核孔进入细胞质在此翻译出蛋白质。7.2 启动子的结构与功能8-*7.2 启动子的结构与功能什么是启动子（promoter）？启动子是RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段DNA序列。 在原核基因中启动子不被转录 原核基因的启动子分为： 核心启动子 启动子上游序列（上游部位）UP原件 两者共同构成原核启动子。null8-*a) 启动子由两部分组成7.2.1 启动子的结构-10 区序列 (Pribnow box)8-*-10 区序列 (Pribnow box)–10 区是在–10位左右的6bp的核苷酸序列，被称为； -10 区或（Pribnow box）或TATA Box; (Pribnow, 1975) 共同的保守序列是 TATAAT; 在大肠杆菌中的其他启动子中，头两个碱基（TA）和最后一个 T 是高度保守的； 这个6个核苷酸的保守序列被6～9（5～ 8）bp从转录起始位点 +1的地方所分开，这个距离对基因的转录水平是非常重要的；-35区序列 Sextama Box8-*-35区序列 Sextama Box在 –35位左右处存在一个6bp的保守序列，称为–35区或 Sextama Box； 共同的保守序列是 TTGACA 在大肠杆菌中的其他启动子中，头三个碱基（ TTG ）是高度保守的； 在所有的启动子中，有约90%是被15～20（16-19）bp 从 –10 区分隔开来； 该区有主要是与RNA聚合酶σ factor 相互作用，增强识别DNA和相互作用；null8-* -35 ~ -10 核心启动子（core promoter） RNApol. 结合位点 -60 ~ -40 启动子上游元件（up element） CAP–cAMP 结合位点Positive site in gene expression and regulationCAP：降解物激活蛋白 （Catabolite Activator Protein）CAP：环化AMP受体蛋白（ cAMP Acceptor Protein ）null8-* 核心启动子区包括 -35 (R)-10 (B)+1 (I)RNAIt can increase to recognize RNA PolyσIt is crucial to loose DNA helixnull转录起始位点 8-*转录起始位点 90%基因的转录起始位点是嘌呤核苷酸（G/A）； 通常在起始位点核苷酸的两侧是 C 或 T （ i.e. CGT or CAT）； 起始位点左右的核苷酸序列影响转录效率；null8-*a) 启动子由两部分组成7.2.2 启动子的功能null8-*λ-C17 TATAAT Gλ-pRE AAGTATCAC -35区突变，影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但不影响转录起点处的解链。-10区突变，不影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但影响双链的解链速度。启动子的定点突变实验null8-*14/16 下调突变2/16 上调突变● -10区中A/T→T/A, 改变了碱基堆积状况改变了RNA聚合酶与模板链的结合效率，转录效率上升（或下降） ● -10区中含有G/C,位点II必须有CAP-cAMP,以改变双螺旋体的稳定性，A/T→G/C 双螺旋体稳定性加强, 转录率下降null8-*l -35区与-10区之间间距17bp, 有利于RNA 聚合酶启动l   -35区或-10区独立发生突变 间距趋近于17 bp，上调突变间距远离于17 bp，下调突变17bp的间距比17bp的序列对转录更为重要！-35区和-10区共同发生突变 → 转录率下降100倍→ 转录率下降1000倍null8-*DNAase I足迹法鉴定启动子区 （foot-printing method） RNA polymerase (no NTP) DNaseI digestion DNA +dissolve RNA聚合酶保护实验null8-*首先将待测双链DNA 片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记, 然后加入恰当浓度的DNase Ⅰ, 使在DNA 链上随机形成缺口, 经 变性后电泳分离, 放射自显影, 即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA 条带. 但当DNA 片段与相应的序列特异性DNA 结合蛋白结合后, DNA 结合蛋白可保护相应的DNA 序列不受DNase Ⅰ的攻击, 因而在放射自显影图谱上, DNA 梯度条带在相应于DNA 结合蛋白的结合区域中断, 从而形成一空白区域, 恰似蛋白质在DNA 上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法. 如果同时进行DNA 化学测序, 即可判断出结合区的精确顺序。null8-*32p-dCTP+dA,T,GTP null8-*The best interval between -10~-35 regionIn prokaryote, the interval between -10~-35 region is about 16~19bp. Promoter activity will be decreased while the interval is <15bp or >20bp.null8-*上游调控元件 （Up element） CAP-cAMP 结合位点 (激活因子区 AR) ● ARI + CAP-cAMP● AR I; IR 是CAP-cAMP的强结合位点 (-60 ~ -50)cooperative effect提高结合 ARII的效率● AR II; IR 是CAP-cAMP的弱结合位点 (-50 ~ -40)null8-* RNApol AR II + CAP-cAMP 复合体 促使Sextama Box 附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降 低，Pribnow Box 的解链温度降低，利于转录启动。 ● AR II + CAP-cAMP promotion RNApol RNApolnull8-*α-CTDARI ARIInull8-*RNA聚合酶识别启动子 RNA pol recognizes promoterRNA聚合酶结合到启动子上游附近的双链DNA模板； 沿双链DNA滑动，找到启动子(promoter)序列； 负责识别启动子的是RNA聚合酶的σ亚基； 真核生物的转录在启动子(promoter)序列处首先结合转录起始因子；null8-*转录起始 Initiation局部DNA解旋和解链，形成转录泡复合体； 在转录的起始位点开始合成RNA，这个起始位点被定为+1，其上游DNA序列标为“–”，其下游DNA序列标为“+”； 当转录出8-9nt时，RNA聚合酶才能够开始进入稳定转录状态；null8-*4. 模板是双链DNA中的反义链DNA，底物是ATP，GTP，CTP 和UTP 4种三磷酸核糖核苷酸。 5. RNA的合成不需要引物。null8-*延伸 Elongation核苷酸以共价键的方式添加在RNA的3’端； RNA聚合酶合成RNA的方向是 5’ 3’ ，而RNA聚合酶本身是沿着DNA的反义链3’ 5’ 方向滑动； 在转录起始、延伸和终止阶段，RNA聚合酶的活性受许多因子的调控。这些因子被称为转录因子和辅助因子（反式作用因子，Trans-acting factors)null8-*终止 TerminationRNA合成终止: 在终止位点RNA聚合酶和新合成的RNA链从DNA模板解离； 终止子: 通常含有自身互补区（self-complementary regions）或称为反向互补区，该区转录的RNA产物能形成茎环结构（stem-loop）或发卡结构（hairpin）。7.3 细菌的RNA聚合酶 Bacterial RNA polymerase8-*7.3 细菌的RNA聚合酶 Bacterial RNA polymerase这是一个DNA模板指导的RNA聚合酶。 主要组成成分 RNA聚合酶核心酶  亚基或因子7.3.1 RNA聚合酶概述1. 大肠杆菌RNA聚合酶null8-*RNA 聚合酶特性1. 这种聚合作用不需要引物； 2. RNA聚合酶的活性需要DNA而且以双链DNA为模板时活性最大，合成RNA的方向是 5’  3’ ； (NMP)n + NTP  (NMP)n+1 + Ppi 3. RNA聚合酶的活性需要 Mg2+ ；null8-*4. RNA聚合酶缺乏 3’  5’ 外切酶活性,通常当合成104 ～105 个核苷酸时会发生1个错误； 5. RNA聚合酶通常是多亚基酶；但也有不是的； 6. 不同生物体的RNA聚合酶不同； 7. 大肠杆菌有一个RNA聚合酶，它合成所有的RNA. 7.3.2 E. coli RNA polymerase8-*7.3.2 E. coli RNA polymerase转录起始和延伸转录起始40 KD40 KD150 KD160 KD10 KD32-90 KD465kdnull8-*Various σ factors recognize different promoter sequences. σ factor functions only during initiation and then dissociates. THERE IS NOT an exonuclease activity from 3’5’. There is no proofreading ability. About 1 error/ 104 nucleotides.大肠杆菌RNA聚合酶: a 亚基 8-*大肠杆菌RNA聚合酶: a 亚基 在核心酶中两个a亚基是相同的； a亚基是由rpoA 基因编码； 对于RNA聚合酶核心蛋白的组装是必需的； 在启动子识别上可能起着重要的作用；null8-*1. β亚基由rpoB 基因编码； 2. RNA聚合酶的催化中心； Rifampicin (利福平)：与β亚基结合可以抑制转录的起始，rpoB 基因突变导致对利福平的抗性； Streptolydigins(利迪链菌素)：抗性突变也定位于 rpoB 基因，它抑制转录延伸，但不抑制起始； 3. β亚基可能含有两个结构域负责转录的起始和延伸；大肠杆菌RNA聚合酶: b 亚基null8-*1. b 亚基由rpoC 基因编码； 2. 与两个Zn2+ 离子结合参与RNA聚合酶的催化功能； Heparin (肝素)：在体外与 β’ 亚基结合并抑制转录； Heparin 与DNA竞争结合RNA聚合酶； 3. β’ 亚基可能是负责与DNA模板的结合；大肠杆菌RNA聚合酶: b’亚基null8-*1. 在启动子的识别上σ 因子至关重要，对于非特异性DNA位点核心酶的亲和力会降低（104），而对于相应的启动子亲和力会增加； 2. 当起始后(RNA chain is 8-9 nt) ，σ 因子会从RNA聚合酶中释放出来； 3. 在细胞中σ 因子的需要量比RNA聚合酶其他亚基的需要量少； 大肠杆菌RNA聚合酶: s亚基null8-*E.coli RNA 聚合酶的亚基性质和功能 亚基 基因 相对分子量 亚基数 功能  rpoA 4.0104 2 core core assemble, promoter recognition  rpoB 1.51105 1 core  and ’combined together to form catalyzed center ’ rpoC 1.55105 1 core  ? 11104 1 core unknown  rpoD 7.0104 1  factor different factors recognize different promoters可解离的sigma亚基赋予RNA聚合酶对原核启动子的特异性8-*可解离的sigma亚基赋予RNA聚合酶对原核启动子的特异性核心酶 Core enzyme 全酶Holoenzyme非特异性结合启动子，并且结合紧密特异性结合启动子，结合程度较弱 RNA聚合酶起始转录8-*RNA聚合酶起始转录核心酶RNA聚合酶的主要功能8-*RNA聚合酶的主要功能①识别和结合DNA链上的启动子； ②能沿DNA双链作单向运动；解开DNA双螺旋，转录后又恢复双螺旋； ③能同时结合单链DNA和转录产物RNA； ④按DNA反义链为模板选择正确的底物NTP，以5’ → 3’方向催化磷酸二酯键的形成，合成RNA链； ⑤识别转录的终止信号； ⑥能够与转录因子相互作用，调节转录速度； ⑦能在转录受到阻遏时进行自我调整，借助辅助因子，恢复和维持RNA的合成。 null8-* 噬菌体T7的RNA聚合酶是比大肠杆菌RNA聚合酶小的单链多肽，约98kD，他们能够快速识别不同于大肠杆菌启动子的启动子，合成RNA (200 nt/sec) 。T7启动子序列为：23bp 5’-AGTTAATACGACTCACTATAGGG-3’7.3.3 T7 RNA聚合酶null8-*1. σ 亚基由rpoD 基因编码；分子量变化较大，从32-90kD， 2. 许多原核生物含有多种σ 因子，以识别不同的启动子。大肠杆菌中最常见的启动子是 σ70，枯草芽孢杆菌是 σ43。 3. RNA聚合酶核心酶结合σ 因子后转变成全酶。 4. 通常有4个结构域，结构域2十分保守并且与σ 因子的功能有关，即识别和结合启动子 -10~-35序列。7.3.4 s亚基的结构1234null8-*5. 结构域2的氨基酸序列呈螺旋，当结构域2 发生突变，σ 因子不能结合启动子； 6. 结构域3有螺旋转角螺旋结构并且是DNA的结合结构域； 7. 结构域4有螺旋转角螺旋结构，它对于结合-35序列起着关键作用； 8 当σ 因子结合到RNA聚合酶时，RNA聚合酶的结构发生变化，并与启动子-10～-15区结合； null8-*1. 核心酶的结构：嗜热水生菌核心聚合酶象一只半张的“蟹钳”一侧由β亚基组成，另一侧由β´亚基组成，两个α亚基位于节点，ω亚基位于底部，覆盖β ´亚基C端。两个“蟹钳”中间有27Å的通道，DNA模板位于其中。 2. α亚基的功能： α亚基是在C端结构域的参与下才与启动子的UP区结合，使相互作用加强，进行高水平转录。 3. 核心酶β和β´亚基的功能：共同构成RNA Pol的催化亚基。 β´亚基结合DNA模板； β亚基催化3 ´ -5 ´磷酸二酯键的合成。7.3.5 核心酶的结构与功能7.3.5 核心酶的结构与功能8-*7.3.5 核心酶的结构与功能RNA poly( ’) 具有与DNA结合的位点，1）上游-6~+1，结合较弱，是盐敏感区；2）下游+2~+10，结合较强，是盐稳定区。null8-*1. σ亚基与核心酶的 β和β´亚基之间有较大的接触面。 2. 缺失前91个aa（1a结构域）的σ亚基组成的全酶不能容纳DNA模板，说明这个结构域负责与DNA的结合。 3. 在σ亚基中连接两个功能域的中间无规则环，靠近酶活性位点，位于排除RNA产物的通道内，它在形成第一个磷酸二酯键是发挥作用。 4. σ亚基的a1区另一个作用是当无核心酶时能阻止σ亚基与DNA结合。7.3.6 RNA聚合酶全酶的结构与功能null8-*5. 在全酶的σ3区和σ4区之间有一段无序的结构延伸到酶活性中心的Mg2+附近，而另一部分有序结构位于RNA逐出通道内与新生RNA竞争占据通道。 6. 当RNA延伸达到12nt以上，RNA就能够通过将σ3-σ4链环置换而继续延伸。7.3.6 RNA聚合酶全酶的结构与功能null8-*启动子(promoter)是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合结合和转录起始所需要的保守序列位点，启动子本身并不转录。 利用DNA足迹法测定DNA Pol 在DNA上的结合位点。 二元转录复合物最初的解链区在-9~+3位置。全酶与启动子的相互作用null8-*全酶与启动子的相互作用1.全酶与DNA接触时占据长度为75~80bp，从-55 ~ +20；2. 进入延伸阶段， RNA pol 伴随σ因子的释放，构象发生变化，覆盖的长度为60 bp; 3. 当新生RNA链聚合15~20bp时，构象进一步发生转变，形成延伸反应复合物，此时覆盖的长度为30~40bp的DNA（形成转录泡）; 4.RNA-DNA杂交链长度8-9bp，最新研究为8bp；null8-*1.全酶中蛋白质-DNA的相互作用都以σ亚基为主；null8-*原核生物转录起始大概分为4个阶段7.3.7 原核生物RNA的转录过程1 启动子起始转录 ( Initiation)（1）RNA聚合酶全酶接触DNA分子，搜索并结合 DNA特异性结合位点；（2）RNA聚合酶与启动子形成封闭型起始复合物；（3）DNA模板解链，封闭型复合物转变为开放型 复合物；（4）酶在起始位点转录9-10nt，DNA-酶-底物 NTP三元起始复合物形成；（5）RNA pol变构，离开启动子区，释放σ亚基。1）RNApoly搜索并结合DNA特异位点Promoter screening and binding8-*1）RNApoly搜索并结合DNA特异位点Promoter screening and bindingThe core enzyme (2 ’) has nonspecific DNA binding (loose binding). The  factor enhances the specificity of the core RNA polymerase for promoter binding (106x) The polymerase first finds the promoter –35 sequences by sliding along the DNA extremely rapidly and forming a closed complex with the promoter DNA (The initial complex of the polymerase with the base-paired promoter DNA)2）RNApoly与启动子形成封闭型起始复合物The formation of a closed complex 8-*2）RNApoly与启动子形成封闭型起始复合物The formation of a closed complex RNA poly(2 ’ ) binds -55 upstream and +20 downstream of DNA promoter unsymmetricaly. The  factor enhances the specificity of the core RNA polymerase for promoter binding at -35 to -10 segment and forming a closed complex with the promoter DNA. Necessary to unwind the DNA so that the antisense strand to become accessible for base pairing, carried out by the polymerase. Negative supercoiling enhances the transcription of many genes but not all (e.g. gyrase) by facilitating unwinding . 3）封闭型起始复合物转变为开放性复合物他The closed complex to opened complex 8-*3）封闭型起始复合物转变为开放性复合物他The closed complex to opened complex The initial unwinding of the DNA results in formation of an opened complex with the polymerase and this process is referred to as tight binding. dsDNA is melting at -10 A-T rich area. Lac promoter was studied and found that opened complex can be formed without CAP-cAMP. That means RNA could not be transcribed. When CAP-cAMP binds to CAP sites on upstream of promoter, dsDNA becomes bending and double helix is unstable and melting at A-T rich area. null8-*When double helix is unstable and melting at A-T rich area, Transcription starts with a GTP (more common) or ATP at initiation site without primer. According to DNA information, the 2nd and 3rd …are added to form a small segment of RNA. The first 9 nt are incorporated without polymerase movement along the DNA or σ factor release This complex is composed of DNA template ,RNA pol and RNA segment and called ternary complex. The RNA polymerase goes through multiple abortive initiations, which are important for the overall rate of transcription The minimum time for promoter clearance is 1-2 seconds (a relatively long event) When RNA chin is constitute 9 or 10 nt, factor leaves RNA pol and core enzyme moves to downstream (elongation).4）DNA-酶-底物三元起始复合物形成 RNA chain initiation (3 elements initiation complex)null8-*σ Factor is released to form a ternary complex of the pol-DNA-RNA (newly synthesized), causing the polymerase to progress along the DNA (promoter clearance) Transcription bubble (unwound DNA region, ~ 17 bp) moves along the DNA with RNA polymerase which unwinds DNA at the front and rewinds it at the rear 3’ part of RNA forms hybrid helix (ca. 12bp) with antisense DNA strand. The E. coli polymerase moves at an average rate of ~ 40~45 nt per sec, depending on the local DNA sequence.2 RNA链延伸(RNA chain elongation)null8-*RNA聚合酶的来源； DNA模板的特殊序列； 予警子的干扰；立体实验 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ppGpp（予警子）影响转录延伸的速度，他与底物之间的无竞争结合聚合酶的作用，说明两者对RNA聚合酶的结合部位不同。 E.coli的nusA蛋白也有调节转录速度的作用。影响RNA链延伸速度的因素3. RNA 转录的终止8-*1）转录的终止子（terminator） 终止子：是基因DNA分子中决定转录产物终止，RNA聚合酶解聚并释放出合成的RNA的DNA序列。（A specific DNA sequence where the transcription complex dissociate） 3. RNA 转录的终止null8-*（1）内源性（内在）终止子/ Rho-independent terminator （2）依赖于因子的终止子/ Rho-dependent terminatorDifficult to identify the primary transcript because pre-mRNA processing In prokaryotes In Eukaryotes 终止子的种类null8-*① 内源性终止子的终止机制 intrinsic terminator: is a Rho independent terminator (simple terminator)null8-*① 存在断裂的反向重复序列，重复序列中含有较多的GC碱基对； a)    结构特征 Structural characteristics ②在模板链DNA链的5’端有连续或不连续的腺苷酸（A）的存在；DNA分子水平上的特征AUGUCGCAGCGGCAUCCUGCCGCUGCGACUUUUUUUUUUU5’3’转录null8-*① 有能自身互补形成茎环结构或发卡结构的反向重复序列（7～20bp），富含GC； a)    结构特征 Structural characteristics ② 在转录的RNA中，G/C 富含区形成茎环结构或发卡结构。其 3’端有连续的U存在；RNA分子水平上的特征富含U区富含GC区null8-*b) 终止机制 富含G/C区→导致转录延迟 转录的RNA形成茎环或发卡 → RNA-DNA富含U/A的碱基堆积力，氢键结合力很弱，结合能力变弱。 RNA 茎环和polyA/U→ RNA 和 DNA 分开 RNA聚合酶脱离null8-*a) 结构Structure l 回文序列形成茎环或发卡二级结构； l 回文序列中不富含G/C，但转录的RNA可形成茎环或发卡二级结构； l 回文序列之后没有A/T富含区，转录的RNA形成发卡之后没有富含U区；② 内在终止子的终止机制 ρ-dependent terminator l 转录的终止需要ρ因子参与；null8-* b) ρ因子ρ因子是分子量为 46KD 的蛋白质； ρ因子是RNA结合蛋白，具有ATPase结合结构域和RNA结合结构域与RNA结合时以六聚体形式存在；覆盖12 nt，共72 nt； ρ因子具有 5’→3’解链酶（helicase）活性；null8-*Rho因子依赖终止子模型3. 当RNA聚合酶转录的RNA形 成发卡结构式，RNA聚合酶暂 停， ρ因子追上RNA聚合酶；4. 终止子和ρ因子共同作用使 转录终止；1.ρ因子结合在新生RNA链特 异位点或二级结构上；2. ρ因子水解ATP提供能量， 沿着RNA向转录泡方向移动；5. ρ因子发挥解链酶活性解 开 RNA-DNA杂交体，使RNA 从DNA模板上释放出来；RNA 聚合酶和ρ因子也释放出来；DNA序列分析富C寡G。7.4 真核生物RNA聚合酶及其转录 RNA polymerase Transcription in Eukaryotes8-* 由于真核生物基因比原核生物在基因组大小、结构有许 多不同之处，因此涉及的转录过程也更复杂；7.4.1 真核生物基因转录概述7.4 真核生物RNA聚合酶及其转录 RNA polymerase Transcription in Eukaryotesnull8-*1）原核基因的转录单位是多顺返子，真核基因转录单位是单顺反子（single cistron）；（启动子，增强子和终止子等） 2）真核生物的RNA聚合酶高度分工。各种RNA有不同的启动子和不同的RNA聚合酶负责转录合成。 3）真核生物基因的转录除RNApol外，还需要多种转录因子（TF）的参与。1 真核生物基因转录的特点null8-*4）真核基因调控转录的顺式作用元件比原核基因复杂的多。（启动子区，增强子序列，负调控序列，可诱导序列等） 5）真核基因转录水平的调控多以正调控为主。转录要求多种蛋白调节因子的协同作用。2 真核基因转录的实验系统8-*主要研究启动子与转录因子 1）爪蟾卵母细胞系统 2）转基因系统 将启动子的基因片段与 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因重组导入真核细胞研究其调控基因的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达情况； 3）体外研究转录因子与启动子的相互作用是通过凝胶阻滞电泳技术。 2 真核基因转录的实验系统3 研究真核基因转录起点的技术8-*1）测定转录起始位点 杂交分析法 ； 引物延伸法； S1核酸酶图谱技术； 32p-UTP标记RNA，提取DNA酶解，用RNA与DNA杂交 2）测定相对转录速度 3 研究真核基因转录起点的技术1. 真核生物RNA聚合酶的分类概述8-*1. 真核生物RNA聚合酶的分类概述7.4.2 真核生物基因转录的RNA聚合酶真核生物基因组大，RNA pol更复杂，分工更细。RNA聚合酶有14～17个亚基，并有Zn2+存在；MW一般在5 × 105～7 × 105 DEAE-Sephadex洗脱三个活性峰 RNA pol I , RNA pol II , RNA pol III. 用α-鹅膏蕈碱（ α- amanitine）可以鉴别三类RNA聚合酶。null8-*Three eukaryotic polymerases2. 真核生物RNA聚合酶的亚基组分8-*2. 真核生物RNA聚合酶的亚基组分真核生物RNA聚合酶有14～17个亚基组成的多亚基蛋白复合体。三类RNA聚合酶的一般特点：1）结构复杂，所有的真核RNA聚合酶比原核的复杂； 2）结构具有相似性，类似与原核RNA聚合酶； 3）三类RNA聚合酶含有一些共同的亚基；RNA聚合酶有三类亚基8-*RNA聚合酶有三类亚基根据结构和功能，将真核生物RNA聚合酶亚基分为核心亚基，共同亚基和非必需亚基。1）核心亚基：在结构与功能上与原核RNAPol的核心酶相关的亚基2 ’。 2）共同亚基：三类RNA聚合酶含有共同的亚基。 3）非必需亚基：一类在RNA聚合酶中含有的功能不清楚的亚基。3. 酵母RNA聚合酶II的空间结构8-*3. 酵母RNA聚合酶II的空间结构酵母RNA聚合酶II与人RNA聚合酶II有52%的序列一致性。1）催化活性位点位于很深的DNA结合裂隙中； 2） DNA结合裂隙如同一个“蟹钳状”； 3）酶的裂隙由碱性氨基酸组成；而表面几乎都是酸性氨基酸； 4）裂隙中的碱性氨基酸有助于酶与酸性DNA模板的结合； 5）在底部有一个能排出RNA的小孔；酵母RNA聚合酶II酵母RNA聚合酶II8-*真核RNA聚合酶活性Eukaryotic RNA polymerase activity8-*真核RNA聚合酶活性Eukaryotic RNA polymerase activity1）Similarities to that in prokaryotic cells 1. Don’t require a primer 2. Synthesize RNA in a 5’ to 3’ direction. 3. RNA complementary to the antisense template strand.null8-*2） Difference to bacterial polymerases There are 3 RNA polymerases Require more accessory factors for binding promoter DNA & initiating transcription. The C-terminus of RNA Pol II largest subunit contains a stretch of heptapeptide repeats, named as carboxyl terminal domain (CTD) Amino acid sequence: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Repeated 26 x (yeast) & 52x in mouse Involved in polymerase phosphorylation during elongation.null8-*4. The CTD is unphosphorylated at transcription initiation, and phosphorylation occurs during transcription elongation as the RNA Pol II leaves the promoter (In vitro results). 5. Because it transcribes all eukaryotic protein-coding gene, RNA Pol II is the most important RNA polymerase for the study of differential gene expression. The CTD is an important target for differential activation of transcription elongation.1.真核生物有三类不同的RNA聚合酶调控转录三类不同的基因转录； 2. 不同基因的启动子不同； 3. 真核生物RNA聚合酶与原核RNA聚合酶不同，需要转录因子的参与识别启动子序列； 4.真核生物基因的调控区包括启动子区和各种顺式调控元件；8-*1.真核生物有三类不同的RNA聚合酶调控转录三类不同的基因转录； 2. 不同基因的启动子不同； 3. 真核生物RNA聚合酶与原核RNA聚合酶不同，需要转录因子的参与识别启动子序列； 4.真核生物基因的调控区包括启动子区和各种顺式调控元件；真核生物基因的启动子概述7.5 真核生物转录的启动子 promoters in EukaryotesRNA Pol I 识别的启动子：控制rRNA前体基因的转录，转录产物经过加工后成为各种成熟的rRNA。8-*RNA Pol I 识别的启动子：控制rRNA前体基因的转录，转录产物经过加工后成为各种成熟的rRNA。rRNA基因的结构； RNA Pol I 的启动子和结合因子； 其他 rRNA 基因； 1. 类型I基因的启动子7.5 真核生物转录的启动子 promoters in Eukaryotesnull8-*Ribosomal RNA基因的共同特征以多拷贝形成串联排列。每个细胞中有数百个拷贝。 每个拷贝内含有 18S, 5.8S 和 28S rRNA，他们作为一个转录单位，受一个启动子的调控；（先转录成 45S rRNA ，然后被加工成 , 5.8S和 28SrRNA.在基因组内，前体Pre-rRNA的转录单位以多拷贝形式成串排列，有非转录的间隔序列所分割； 3. rRNA基因的转录单位的长度比3种成熟的rRNA的总和要长；null8-*单一拷贝的转录单位多拷贝排列null8-*rRNA基因多拷贝连续转录对产生足够的rRNA组装核糖体是必需的； rRNA基因簇 (cluster)盘绕一起形成核仁，也称为核仁组织者区； 在 rRNA 激活合成过程中，转录的 pre-rRNA沿rRNA基因（rDNA）排列，在电镜下可见“圣诞树Christmas tree structures”样的结构；null8-*Christmas Tree Structuresnull8-*RNA聚合酶 I 启动子通常在起始位点处为双向序列（起始位点上下），包括核心元件（core element）和上游调控元件（upstream control elements） ； 在人类细胞最典型： Core element: -45 ～ +20, 对转录是必需的； Upstream control element (UCE): -156 ～ -107，可增强转录效率 (10～100x ). 3. 序列的删除比插入更易影响转录效率；两个区域都富含G:C，且有 ~85% 相同； null8-*人类细胞中RNA聚合酶I的启动子 RNA Pol I promoters in human cellsRNA聚合酶I的两种转录因子（辅助因子）Two ancillary factors (UBF1 and SL1) 在转录起始中的作用8-*RNA聚合酶I的两种转录因子（辅助因子）Two ancillary factors (UBF1 and SL1) 在转录起始中的作用null8-*上游结合因子（Upstream binding factor ,UBF） A specific DNA-binding protein that binds to UCE (upstream control element), as well as to the upstream of the core element. UBF is essential for high level of transcription. 2. 选择因子1（Selectivity factor 1，SL1） Binds to and stabilizes the UBF-DNA complex, but by itself no specificity for promoter. Interacts with the free downstream part of the core element. Recruit RNA Pol I to bind and to initiate the transcription. (essential)null8-*Subunits of SL1SL1 consists of 4 proteins. 1. (TATA-binding protein) is a factor required also for initiation by RNA Pol II and III. A critical general factor in eukaryotic transcription that ensures that the RNA Pol is properly localized at the start point. 2. Other three subunits are referred to as TBP-associated factors (TAFIs) that are specific for RNA Pol I transcription.null8-*The initiation complex assembles in three stagesinteractionnull8-*The initiation complex The distance is very important. Deletion of 16bp, decreasing to 40%. Deletion of 44bp, decreasing less to 10%. Insert of 28bp, no effects to transcription. Insert of 49bp, decreasing 70%. -45~+20-156~-107null8-*Other rRNA genes (simple)In a simple eukaryote, Acanthamoeba（棘阿米巴属）, the rRNA genes have only one control element (promoter) around 12-72 bp upstream from the transcription start site. Simple initiation: TIF (homolog of SL-1) binds to the promoter  RNA Pol I bind  Initiation  TIF remains bound at promoter during RNA elongation.RNA Pol II 识别的启动子：控制蛋白质编码基因的启动子，转录产物经过加工后成为各种成熟的mRNA。这类启动子属于起始位点上游启动子。8-*RNA Pol II 识别的启动子：控制蛋白质编码基因的启动子，转录产物经过加工后成为各种成熟的mRNA。这类启动子属于起始位点上游启动子。典型的类型II启动子结构由核心启动子和上游原件两大部分组成 核心启动子由4个小元件组成： 起始子（Inr）；PyPyAN(T/A)PyPy (--ANAUGG) TATA框，位于-25~-30位TATAAAA； 上游的TIFIIB识别元件（BRE） G/CG/CG/ACGCC； 下游启动子元件（DPE）；位于起点下游30bpGA/T CG 2 类型II基因的启动子类型II启动子结构8-*类型II启动子结构核心启动子由4个小元件组成： 起始子（Inr）；PyPyAN(T/A)PyPy (--ANAUGG) TATA框，位于-25~-30位TATAAAA； 上游的TIFIIB识别元件（BRE） G/CG/CG/ACGCC； 下游启动子元件（DPE）；位于起点下游30bpGA/T CG （1）转录起始点8-*（1）转录起始点转录起始位