几种DNA提取方法对红树植物DNA提取效果的比较-再改稿

几种DNA提取方法对红树植物DNA提取效果的比较-再改稿 几种DNA提取方法对红树植物DNA提取效果的比较 1,21,2 2233 丁文勇陈少波**仇建标刘伟成徐海王益权 12(温州医学院生命科学学院 浙江 温州 325035，浙江省海洋水产养殖研究所浙江省近岸水 域生物资源开发与保护重点实验室 浙江 温州 325005， 3西北农林科技大学资源环境学院 陕西712100 ) 摘要:红树林是发育于特殊环境的植物群落，红树植物也因其富含单宁而出名，其细胞壁含有大量的单宁和多糖等物质。单宁是一种能与蛋白质和其他化合物形成交联能力的酚化合物，核酸提取过程中，大量的单宁能与蛋白质结合，而且单宁与生物碱和多糖也可发生跟单宁与蛋白质结合相似的复合反应，而大量多糖的存在，能与DNA形成共沉淀，从而影响了核酸的纯度。以红树植物秋茄叶片为实验材料，美人蕉叶片为对照材料，采用6种不同的DNA提取方法，比较不同方法的DNA提取效果。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:针对红树植物优化的CTAB法(方法6)通过PVP的除酚去多糖作用，利用CTAB提取液和氯仿-异戊醇强效除蛋白和脂类物质，结合高盐环境下异丙醇高效沉淀DNA去除多糖，最终达到彻底去除杂质，得到高纯度的基因组DNA，是6种方法中最适合用于红树植物DNA的提取方法。 关键词:红树植物;DNA提取;多糖;改进的CTAB法 *国家海洋公益性行业科研专项经费项目(200805072). 国家海洋公益性行业科研专项经费项目(201005012). 国家海洋局项目《高纬度红树林生态分析与移植技术研究》. 浙江省科技厅创新团队建设与人才培养项目(2009F2009). 浙江省科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2008F1009). **[作者简介]丁文勇(1986-)，男，浙江缙云人，在读研究生，主要从事植物分子生物学研究。E-mail: dwy8623@126.com [通讯作者]陈少波，男，浙江温州人，教授，博士，主要从事海洋水产养殖、资源保护和开发利用以及 病害防治等研究。E-mail:chenshaobo@hotmail.com; Comparison of the efficiency of different DNA extraction methods on mangrove 1,21,22233Ding Wen-yong ,Chen Shao-bo, Qiu Jian-biao, Liu Weicheng, Xu Hai, Wang Yiquan 1( School of Life Sciences, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325015, Zhejiang, China, 2Zhejiang Mariculture Research Institute, Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and 3Preservation of Coastal Bio-resource, Wenzhou 325005, Zhejiang, China, Colleage of Resources and Environment, Northwest A & F University712100, Shanxi, China,) Abstract: Mangrove is a very special plant community in shallow tidal flat of land-sea border. It is famous for its richness in vegetable tannins and polysaccharides in its cell walls and when it is cut and oxidated it turns to be red. Tannin is a kind of phenolic compounds which can get combined with proteins and other compounds like ysaccharides by its cross-linking ability. When extracting DNA from the mangrove pol material, the large quantities of tannins get together with proteins and polysaccharides , and polysaccharides can also coprecipitate together with DNA, thus affecting the purity of nucleic acid. In this paper, we used 6 different methods to extract DNA from the leaves of the mangrove plant Kandelia obovata. By comparing different methods of DNA extraction, we found that: the modified CTAB method (Mothod.6 in this paper) , by using PVP and 5 mol/L NaCl to get rid of tannins and polysaccharides，together with the function of CTAB buffer, Chloroform: Isoamyl alcohoL(24:1) and Isopropanol, successfully purified the DNA, thus to make it the most suitable method for extracting DNA from the mangrove material. Key words: mangrove; DNA extraction; tannins and polysaccharides; modified CTAB method 红树林(Mangrove)是一种热带、亚热带特有的海岸带植物群落。它生长于陆地与海洋交界带的滩涂，是陆地向海洋过度的特殊生态系统。由于红树林生长在陆海交界处，是陆地的天然屏障，对减少台风等自然灾害造成的破坏有重要 [1]的意义;红树林生态系统还具有吸收积累重金属元素、清除有机氯农药改善环境质量的作用;能净化水体过滤陆地径流和内陆带出的有机物质和污染物，降解 [2]污染物;在多样性保护方面，它为许多海洋动物、鸟类提供栖息和觅食的理想生境，保护生物多样性和防治病虫害，素有“海底森林”、“水上绿洲”和“潮汐森林”之称，其生物资源量非常丰富，是至今世界上少数几个物种最多样化的生态 [3]系统之一。同时，红树林生态系统还具有生态旅游、科学研究、文化教育等重要价值。另外，红树林植物还是重要的化工原料及药物来源。 随着科学技术的发展以及人们对生态环境保护意识的加强，红树林生态系统也越来越成为人们研究和开发的热点，分子水平上对红树林植物的研究也越来越[4~6]多。但是，由于红树植物的特殊性，分子水平上的研究也存在一些难点，其中之一就是红树植物的DNA提取。DNA的分离提取是进行植物分子生物学研究 工作的基础，DNA的提取效率和纯度严重影响分子生物学实验的结果，因此快 [7]速提取得到高纯度的DNA，是分子生物学实验成败的关键因素之一。 一般陆地植物的DNA提取方法已经非常成熟，常见的有传统的CTAB法、SDS法等。但红树植物因其细胞壁含有大量的单宁和多糖等物质，使其DNA提取存在一定的难度。单宁是一种能与蛋白质和其他化合物形成交联能力的酚化合物，核酸提取过程中，大量的单宁能与蛋白质结合，而且单宁与生物碱和多糖也 [8]可发生跟单宁与蛋白质结合相似的复合反应;而大量多糖的存在，使得其与 [9]DNA形成共沉淀，从而影响了核酸的纯度。目前国内外最常采用的除多糖的方法是采用经典的CsCl超速离心的方法，但此方法对实验设备和操作技术要求 [10][11]较高，而且花费较高。也有研究人员采用诸如柱过滤等纯化方法，虽然较好地纯化了基因组DNA，但在纯化过程中易造成基因组DNA的损失和断裂，不能够满足如酶切连接等对DNA具有高要求的操作。本文通过比较6种不同的DNA提取方法，采用红树植物秋茄(Kandelia candel.)为实验材料，并用新鲜的的美人蕉(Canna indica)叶片材料作为对照，探索适合于红树植物DNA提取的方法。 1材料与方法 1.1材料: 1)新鲜的美人蕉(Canna indica)叶片(标记为M)。 2)干制的红树植物秋茄(Kandelia candel.)叶片样本(标记为Q) 1.2方法 分别采用以下6种方法，提取美人蕉和秋茄两种材料的基因组DNA。并记录实验过程中观察到的溶液颜色及沉淀形态变化。实验材料统一称取0.2g组织，提取产物统一用0.1ml TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA)溶解。6种方法的实验结果分别以M1、M2……M6和Q1、Q2……Q6标示。 [12]方法1:改良SDS法 1) 称取0.2g样本用液氮研磨成粉，加入1mL提取液(500mmol/L NaC1， 50mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA，2% β-巯基乙醇)室温数分钟解 冻后加入0.5mL 10% SDS溶液，轻轻混匀于65?保温30min; 2) 取出后立即置于冰上，加0.24mL 5mol/L KAc溶液于冰上反应30min; 10000g，4?离心20min;取上清液加1倍体积的异丙醇，-40?放置30min; 10000g，4?离心20min; 3) 用0.5mL TE缓冲液溶解沉淀，加等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，混 匀;10000 g，4?离心10min; 4) 取上清液加0.8倍体积-20?预冷的异丙醇和1,10体积的3mol/L NaCl，-20?静置30min沉淀DNA;10000g，4?离心20min; 5) 70,的乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干后溶于0.1ml TE，4?保存备 用。 [13,14]方法2:高盐低PH法 1) 称取0.2g样本用液氮研磨成粉，加入1mL 65?预热的提取液 (100mmol/L 醋酸钠，50mmol/L EDTA，500mmol/L 氯化钠，3, SDS，1, β-巯基乙醇 pH5.5)充分混匀于65?中保温30min;10000g，4?离心10min; 2) 取上清液加2/3倍体积的2.5mol/L (pH= 4.8)的KAc溶液，4?放 置15min;10000g，4?离心10min; 3) 取上清液加等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，10000g，4?离心20min; 4) 取上清液加等体积的-20?预冷的异丙醇，-20?静置20min沉淀DNA;10000g，4?离心10min; 5) 用70%的乙醇洗涤DNA 沉淀2次，风干后溶于0.1ml TE缓冲液。 [15]方法3:传统的CTAB法 1) 称取0.2g样品用液氮研磨成粉，加入1mL预热的CTAB抽提液(2% CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0，20m mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巯基乙醇)，充分混合，于65?温浴10~60min，不时混匀。 2) 用等体积的氯仿-异戊醇(24:1)抽提匀浆液，颠倒混合，10000g，4?离心10min。 3) 取上清，加入1/10体积65? CTAB/NaCl，颠倒混匀，用氯仿-异戊醇(24:1)抽提，离心回收上清。 4) 加入等体积CTAB沉淀液，颠倒混匀， 2700g，4?离心5min。移出上清，用TE缓冲液重悬沉淀。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀核酸，充分混合，于10000g， 4?离心15min。 5) 用70%乙醇洗涤沉淀，风干后溶于0.1ml TE缓冲液。 [16]方法4:“海刀豆DNA的提取”方法 1) 称取0.2g样品置于冷研钵中(0~4?冰浴)加入1mL研磨缓冲液(0.45mol/L NaCl，0.45 mol/L柠檬酸钠，0.1 mol/L EDTA，1% SDS，pH7.0)，研磨成匀浆状。 2) 加入等体积饱和酚(1 mol/L Tris饱和重蒸酚，pH 8.0)，温和摇动10min，以除去蛋白和使内源DNase(DNA酶)失活。 3) 2500g，室温离心10min，取上清液加2倍体积氯仿-异戊醇(24:1)，温和摇动10min;2500g，室温离心10min，收集上层清液。反复抽提至界面无蛋白为止。 4) 加2倍体积-20?冰冷乙醇沉淀DNA，置于-20?冰箱过夜，10000g， 4?离心10min，沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液，得到粗DNA溶液。 5) 往粗DNA液中加灭活的DNase液(RNase溶于0.15mmol/L NaCl，pH5.0)，终浓度为50mg/ml，30?，保温10min，除RNA。 6) 加氯仿-异戊醇除蛋白(同3)，乙醇沉淀DNA后，10000g，4?离心10min，风干后沉淀溶于0.1ml TE缓冲液。 [17]方法5:常用改良的CTAB法 1) 称取0.2g样品，用液氮研磨成粉，加1mL CTAB抽提缓冲液(2% CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0，20m mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巯基乙醇)，64?保温30~60min左右，并每10min左右翻转一次。 2) 在上述样品中加入等体积Tris-酚和氯仿-异戊醇(24:1)，充分混合，10000g ，4?离心10min。 3) 取上清，加等体积的CI， 10000g，常温离心10min。 4) 取上清，加1/5体积3mol/L NaAc溶液和2倍体积的95%冰冷乙醇，轻微混匀后于-20?条件下沉淀40min以上。沉淀后10000g， 4?离心10min。 5) 用70%乙醇洗涤沉淀，风干后溶于0.1mL TE缓冲液。 方法6:针对红树植物优化的CTAB法 1) 称取0.2g样品用液氮迅速充分研磨成粉末，加入1mL预热的2% CTAB抽提液(2% CTAB，0.1 mol/L tris-HCl pH8.0，20m mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% β-巯基乙醇，2% PVP)。 2) 放入水浴锅中 55?温浴45min~90min，并每隔10分钟轻轻颠倒摇晃一次，使其充分混合;加入少量 Rnase(RNA酶)，37?保温1h~2h处理;加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，充分混合，于10000g ，4?离心10min。 3) 取上清，加入0.5倍体积预热的2% CTAB抽提液，再加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，充分混合，10000g，常温离心10min。 4) 取上清，加入1/5体积5 mol/L NaCl，并加入2/3体积的冰冷异丙醇，轻轻摇晃混合， -20?条件下放置90min以上沉淀DNA，10000g ，4?离心10min。 5) 弃上清，回收沉淀，用70%乙醇充分洗涤，风干后溶解于0.1ml TE 缓冲液。 1.3 总DNA的定性和定量检测 以1Kbp DNA Ladder Marker 为参照，用1%的琼脂糖凝胶电泳做定性分析。将提取的DNA 样品做稀释100倍后，用紫外分光光度法分别测定OD，OD260280值并计算OD/OD以检验纯度。 260280 1.4 重复实验 选用DNA提取效果较好的方法，进行重复实验，并采用其它红树植物材料进行DNA提取，验证其DNA提取效果。 2结果与分析 2.1实验过程中观察结果的比较 表2 不同提取方法实验过程中的颜色及形态变化 Table 2 Changes of the colors or shapes during the experiment with different methods 方法 材料 研磨后 抽提后 沉淀后 方法1 深绿色 黄色 大量棕色胶状沉淀 Q1 鲜绿色 浅黄色 大量浅黄色絮状沉淀 M1 方法2 深绿色 黄色 大量褐色胶状沉淀 Q2 鲜绿色 浅黄色 少量浅黄色絮状沉淀 M2 方法3 深绿色 浅黄色 大量浅黄胶状沉淀 Q3 鲜绿色 微黄色 少量乳白色絮状沉淀 M3 方法4 深绿色 黄色 大量褐色胶状沉淀 Q4 鲜绿色 浅黄色 大量乳白色絮状沉淀 M4 方法5 深绿色 微黄色 少量浅黄胶状沉淀 Q5 鲜绿色 无色 少量白色絮状沉淀 M5 方法6 深绿色 无色 少量白色絮状沉淀 Q6 鲜绿色 无色 少量白色絮状沉淀 M6 注:“抽提后”颜色为每种方法步骤3离心后取上清液颜色; “沉淀后”为每种方法步骤4沉淀离心后。 [18]从表1可知:不同的DNA提取方法对同一种植物的DNA抽提效果不同，本实验中方法6的抽提效果最明显，抽提后颜色为无色，而其他方法除方法5对新鲜美人蕉材料抽提后颜色为无色外，抽提后都有一定的颜色，说明有叶绿素等蛋白存在。其中以方法1、方法2和方法4颜色最深，表明蛋白质含量较多，抽提效果较差。沉淀物的颜色和形状也与抽提效果具有一致性，方法6沉淀后为少量白色絮状沉淀，表明提取效果较好。方法5中新鲜美人蕉材料沉淀后也为少量白色絮状沉淀，而干制的秋茄叶片样本沉淀后为少量浅黄胶状沉淀，表明方法5对新鲜的一般植物材料提取效果较好，但是对含有较多多糖和单宁的干制红树植物样本提取效果欠佳。其他几种方法所得沉淀中均含有较多有色的杂质，提取效果不是非常理想。 2.2电泳检测结果比较 根据电泳结果(图1):除方法1外，其他5种方法从新鲜美人蕉材料中提取得到DNA都有条带，方法6所得条带的亮度最大;而从干制的秋茄叶片样本提取的DNA只有方法3、方法5和方法6有条带，而且方法3和方法5的条带亮度都很微弱，只有方法6所得DNA条带较亮。由此可见，方法6所提取DNA的效果最好。 图1 用6种方法提取的基因组DNA电泳图片 Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by 6 methods 注:Q1—M6依次为6种方法提取的秋茄和美人蕉样品的基因组DNA，M为1Kbp DNA Ladder Marker 2.3 紫外分光光度法测定结果比较 DNA溶液的纯度用OD260/OD280的比值来表示，当OD260/OD280比值接近1.8时，DNA纯度符合质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ;当OD260/OD280比值大于1.9时，表明有RNA污 [19, 20]染，小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染。根据本实验中紫外分光光度分析(表2):方法1中q1吸光比值较为异常(0.9431，远小于1.6)，可能是因为提取的DNA含有较多的蛋白质、多糖或酚等杂质，用TE溶解DNA后颜色依然较深，从而导致吸光比值异常。m3、q6、m6吸光比值较接近1.8，表明所提取的DNA质量较好。方法6所提取的DNA的OD260/OD280比值接近1.8，表明所提取的DNA质量较好。 表2 六种方法所得DNA样品的纯度 Tab 2 The purity of extracted DNA by 6 methods 材料 OD260 OD280 OD260/OD280 Q1 0.0029 0.0031 0.9431 M1 0.0121 0.0054 2.2399 Q2 0.0345 0.0157 2.1952 M2 0.0388 0.0218 1.7824 Q3 0.0434 0.0210 2.0705 M3 0.0383 0.0210 1.8268 Q4 0.0026 0.0015 1.7287 M4 0.1131 0.0535 2.1161 Q5 0.0381 0.0201 1.9004 M5 0.0755 0.0385 1.9589 Q6 0.0759 0.0412 1.8434 M6 0.0499 0.0270 1.8471 2.4 重复实验结果 采用方法6对秋茄材料进行10次重复实验，并采用其它红树植物材料木榄(Bruguiera gymnoihiza)、桐花(Aegiceras corniculatum)、白骨壤(Avicennia marina)进行DNA提取效果的比较，电泳检测结果(图2)表明:用方法6提取的 秋茄DNA纯度较好，提取效果稳定、可靠，并适用于其它红树植物DNA的提取。 图2 方法6提取的基因组DNA电泳图 Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by Method.6 注:1~10为秋茄干样本基因组DNA，11~14依次为秋茄、木榄、桐花、白骨壤样本基因组DNA，M 为1Kbp DNA Ladder Marker 讨论 3 3.1 选材 实验材料的选择是实验过程的第一步，不同的植物用相同提取方法其DNA [20, 21]纯度和提取率不同，同一植物用不同方法其提取其结果也不一样。采用同一植物的不同部位提取的DNA纯度和提取率也不尽相同，一般含较多多糖和单 [22, 23]宁的盐生植物如红树植物，取材时应尽量选取处于生长旺盛期的幼嫩组织。 本实验中选择美人蕉作为实验对照，美人蕉是一种常见的多年生进立草本植物，所含单宁和多糖的量较少，在一般植物DNA提取上具有代表性。而且，选取的美人蕉材料为新鲜幼嫩的叶片，而秋茄为干制的成熟叶片。由实验结果可知:除方法1外，其它方法提取美人蕉的DNA都有条带，表明常规提取方法对普通植物都是有效的;而对于秋茄，只有方法6提取效果较好，其它方法都欠佳，表明常规提取方法难以从含有大量多糖和单宁的植物中可靠地提取出高质量的DNA。而方法6的提取结果表明了其除多糖的效果较好，即使在无法获得新鲜幼嫩材料时，也可以从成熟的红树植物叶片中提取得到高质量的DNA。 3.2 杂质分离 在DNA的提取过程中，杂质的去除是得到高纯度DNA的关键。实验操作过程中颜色的变化能够在一定程度上反映出杂质去除的效果。本实验列出了抽提后和沉淀后的颜色变化，对比电泳和紫外分光光度检测结果可得:抽提后和沉淀后颜色较深表明杂质去除的效果较差，颜色较浅表明明杂质去除的效果较好。方法6提取过程中颜色最浅，表明其分离杂质的效果最好。 比较6种方法，只有方法6中加入了2%体积的PVP。PVP是一种抗氧化剂，它的主要作用有:与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除酚化合物;并且能与多 [24~26]糖结合，使多糖在抽提过程中与DNA分离。这对于含有较多酚化合物(如单宁)和大量多糖物质的红树植物干制材料具有非常明显的去除酚和多糖的效果。 方法1~方法5提取得到的DNA因含有大量的多糖和DNA的复合物，从而呈现凝胶状，对后续实验将造成很大的影响。方法6中加入了1/5体积5 mol/L NaCl进行高盐沉淀。利用高盐缓冲条件下，在异丙醇中DNA优先沉淀的性质，达到使DNA与多糖分离的目的，因而在含有大量多糖的红树植物DNA提取过程中，加 [27~29]入5 mol/L NaCl能够有效地去除多糖的影响。 此外，方法6中将传统的酚:氯仿抽提法加入等体积的Tris饱和酚换成加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)。酚具有较强的变性作用，能够除去蛋白质，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%~15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA。而且酚易氧化，氧化后容易降解DNA。因而用氯仿-异戊醇(24:1)代替Tris饱和酚能够提高DNA的得率。而且氯仿-异戊醇比Tris饱和酚毒性小，使实验过程更具安全性。 方法1为传统的SDS法，在动植物DNA的提取中都有所应用，但是在动物DNA提取中应用较为广泛。在本实验中，方法1的DNA提取效果较差，可能原因是:1)SDS对蛋白质的去除效果较好，但是对植物中复杂的多糖和单宁的去除效果不够好;2)沉淀后用TE溶解再抽提，DNA损失较多，对DNA提取得率影响较大，因此秋茄和美人蕉样品都未能提出DNA。 方法2、方法3和方法5都没有专门除多糖的步骤，所以对红树植物的DNA提取效果都欠佳。而方法4是针对红树植物海刀豆的提取方法，其使用的研磨缓 [16]冲液主要成分是柠檬酸钠，能较干净地去除蛋白质，但是其对多糖的去除效 果不好。而且与方法1类似，其沉淀后用TE溶解再抽提，对DNA造成的损失 较大。 4(小结: 通过6种不同的DNA提取方法的比较可知:自行改进的CTAB法(方法6) 最适合红树植物DNA的提取。方法6通过PVP的除酚去多糖作用，利用CTAB 提取液和氯仿-异戊醇强效除蛋白和脂类物质，结合高盐沉淀除去多糖，以及异 丙醇高效沉淀DNA，最终较彻底去除杂质，得到高纯度的基因组DNA。方法6 还解决了实验取材的限制，在无法满足新鲜幼嫩材料时，也可以采用干制的材料 提取得到较好的DNA。而且通过重复实验，得到的DNA条带电泳检测结果都较 好，说明此方法较可靠、稳定。通过用此方法对其它种类红树植物材料进行DNA 提取，得到的DNA条带电泳检测结果也都较好。加上此方法操作简单，安全快 速，综上说明方法6是一种适合于红树植物DNA提取的方法。 参考文献: [1] 陈映霞. 红树林的环境生态效应[J]. 海洋环境科学, 1995, 14 (4): 51~56. 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