TaqMan-MGB探针检测骨髓增殖性疾病患者JAK2V617F突变

TaqMan-MGB探针检测骨髓增殖性疾病患者JAK2V617F突变 TaqMan-MGB探针检测骨髓增殖性疾病患 者JAK2V617F突变 !生!旦7卷第34期NadMedJChina,September11.2007.Vo187.Nn34 TaqMan—MGB探针检测骨髓增殖性 疾病患者JAK2V617F突变 阮国瑞陈珊珊李玲娣刘艳荣秦亚溱李金兰 马曦王峰蓉江倩江滨刘开彦黄晓军 【摘要】目的建立实时定量PCR检测骨髓增殖性疾病(MPD)患者JAK2V617F突变的方法. 方法利用TaqMan—MGB探针,检测MPD患者JAK2V617F突变,部分标本用等位基因特异的定性 PCR及测序的方法同时进行验证.结果374份患者和对照的骨髓或外周血标本被用于JAK2 V617F突变分析.其中76例PV,115例ET和19例MF患者JAK2V617F突变的检出率分别为70%, 51%及58%;65例急性髓性白血病中仅1例为阳性,而38例慢性髓性白血病,30例急性淋巴细胞白 血病,8例慢性淋巴细胞白血病,7例非霍奇金淋巴瘤及16例正常供者骨髓细胞中的检出率均为0. 结论JAK2V617F突变在我国MPD患者中是广泛存在的.利用TaqMan—MGB探针进行实时定量 PCR的方法可快速,准确地检测JAK2V617F突变. 【关键词】骨髓增殖性疾病;JAK2;突变;聚合酶链反应 DetectionofJAK2V617Fmutationinpatien~withmyeloproliferativedisorderswithTaqM an.MGB probeRUANGuo—mi,CHENshnn—shan,LIng一出,HUYan—rong,QINIra— zhen,LIfin—lan,MAXi, WANGFeng—rong,JIANGQian,JIANGBin,HUKai— yan,HUANGXiao-jun.PekingUniversityInstituteof HematologyandPeopletsHospita1.BetnglO0o44China 【Abstract】 0bjectiveTodevelopanovelplatformfordetectionoftheJAK2V617Fmutationin patientswithmyeloproliferativedisorders(MPD)byreal— timequantitativePCR,MethodsTaqMan—MGB probewasconstructed.Peripheralbloodsampleswerecollectedfrom374MPDpatients.76with polycythemiavera(PV),38withchronicmyelogenousleukemia(CML),and115withessential thrombocythemia(ET),and19withidiopathicmyelofibrosis(IMF).Peripheralbloodsamplesfrom65 patientswithacutemyelogenousleukemia(AML),30patientswithacutelymphoblasticleukemia,8 patientswithchroniclymphoblasticleukemia.and7patientswithnon— Hodgkinslymphomaand16casesof normaldonorbonemarrowwereusedascontrols.GenomicDNAorRNAwasextractedandreversely transcrtibedintocDNA.TaqMan— MGBprobewasusedtodetecttheJAl(2V617FmutantinMPD, Furthermore.168specimensunderwentallelespecificPCRand8specimensunderwentsequencing.This methodwasusedonbothDNAandcDNAspecimensfrom38MPDpatientssimultaneouslysoastotestthe consistency.ResultsTheJAl(2v617FmutationratesofthePV,ET,andIMFpatientswere53(70%), 59(51%),(58%)respectively.JAl(2V617Fmutationwasfoundinonlyoneofthe65AMLpatientsand wasnotidentifiedinothercontrolspecimens.BoththeresultsofallelespecificPCRandofseq uencingwere consistentwiththeresultofTaqMan—MGBprobemethod.ConclusionJAK2V617Fmutationiswidespread inChineseMPDpatients.Real—timequantitativePCRwithTaqManMGBprobecanbeusedforrapidand accuratedetectionoftheJAl(2V617Fmutation. 【Keywords】Myeloproliferativedisorders;JAK2;Mutation;PolymeraseChainReaction 骨髓增殖性疾病(MPD)是一组由一种或多种 血细胞成分异常增殖所致的疾病.四种主要的 MPD分别为慢性髓性白血病(CML),真性红细胞增 多症(PV),原发性血小板增多症(ET)和原发性骨 髓纤维化(IMF).其中,95%以上的CML患者存在 BCR/ABL融合基因,PCR—BCR/ABL检测已成为用于 作者单位:100044北京大学人民医院血液病研究所(阮国瑞,陈 珊珊,李玲娣,刘艳荣,秦亚溱,李金兰,王峰蓉,江倩,江滨,刘开彦, 黄晓军),北京大学疾病基因研究中心(马曦) ? 240l? . 临床研究. CML诊断的常规项目,而其余3种MPD分别是影响 红细胞系,巨核细胞系及骨髓微环境的恶性肿瘤,长 期以来,未发现特异的分子诊断 标志 禁止坐卧标志下载饮用水保护区标志下载桥隧标志图下载上坡路安全标志下载地理标志专用标志下载 .2005年, 有关MPD发病机理研究的主要进展是发现部分 PV,IMF和ET患者具有JAK2(Januskinase2) V617F突变,JAK2核苷酸1849位上G突变为T,导 致在JAK2的假激酶域中第617位密码子的氨基酸 残基由缬氨酸(V)突变为苯丙氨酸(F),即 JAK2V617F,该突变是造血前体细胞中的体细胞突 变,它介导激活JAK/STAT途径,进而导致细胞异常 !生!月11日第87卷第34期Nat]MedJChina 增殖?.这一发现,不仅使快速,可靠诊断MPD成 为可能,而且可针对突变型JAK2开发出与甲磺酸 伊马替尼类似的新的靶向疗法,将为MPD提供一种 新的治疗方法.我们建立了TaqMan—MGB探针 (TaqManMinorGrooveBinderProbe.TaqMan—MGB 探针)检测JAK2V617F突变的方法,并对MPD患者 进行了检测. 对象与方法 , ,研究对象 成人MPD患者248例,其中PV76例,ET115 例,MF19例,CML38例(均为BCR/ABL融合基 因阳性),急性髓性白血病(AML)65例,急性淋巴细 胞白血病(ALL)30例,慢性淋巴细胞白血病(CLL) 8例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)7例及正常供者骨髓 (NDM)16例,诊断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 依据世界卫生组织新的分型 标准.本试验经本院伦理委员会批准,患者骨髓穿 刺前签署知情同意书. 二,方法 1.待测样品基因组DNA及cDNA制备: JAK2V617F纯合突变基因型rrI'阳性对照HEL细 胞及野生基因型GG对照K562细胞,为本室保存, 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(美国 GIBCO公司)在5%CO:孵箱中常规大量培养,取对 数生长期细胞用于DNA或RNA提取.患者及正常 骨髓移植供者的骨髓或外周血标本,参照DNAzol或 TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书在无菌 条件下提取基因组DNA或RNA,方法为:用 NaEDTA抗凝,用淋巴细胞分层液(相对密度1.077 g/L,上海华精高科技有限公司)分离出单个核细 胞,将分离出的单个核细胞及用常规方法培养的 HEL(纯合突变阳性对照细胞),K562细胞系细胞 (阴性对照细胞)用生理盐水洗涤2次后,加人60O txlDNAzol试剂,或1mlTRIz0l试剂,参照试剂盒说 明提取DNA或RNA,RNA按本室常规逆转录成 cDNAE. 2.PCR扩增:根据JAK2的基因组基因及cDNA 中包含第617位氨基酸残基(野生型为缬氨酸, JAK2V617F突变体为苯丙氨酸)编码序列的基因序 列(野生型JAl(2基因的GenBank号:NT_008413;野 生型JAK2基因cDNA的GenBank号:NM_004972, JAK2V617F突变基因是将野生型基因自5端第617 位的缬氨酸的密码子GTC突变为苯丙氨酸的密码 子TI'C)及其反向互补序列用PrimerExpress Software2.0软件分别 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 一对PCR引物,同时根 据野生型JAK2激酶基因及JAK2激酶JAK2V617F 突变基因的反向互补序列设计2条TaqMan—MGB探 针,将2条TaqMan—MGB探针的5端分别标记报告 荧光基团FAM(蓝色荧光)和VIC(绿色荧光),3端 标记不发光的淬灭基团,并连接二氢环化吲哚卟啉一 三肽(DPI3),引物,TaqMan—MGB探针序列及其解链 温度和GC含量见表1.2. 表1检测JAK2V617F突变的引物,探针序列及其 解链温度和GC含量(DNA) 引物和探针序列长度解 (T 链 mG手 表2检测JAK2V617F突变的引物,探针序列及其 解链温度和GC含量(cDNA) 引物和探针序列长度解 (T 链 m c,c (% ~ ) i 以提取的DNA或cDNA为模板,在相应引物及 探针的引导下,用ABI7500实时荧光定量PCR仪 (美国应用生物系统公司)进行PCR扩增,并按等位 基因鉴别实验操作步骤(具体方法参见美国应用生 物系统公司7300/7500实时定量PCR仪人门 指南 验证指南下载验证指南下载验证指南下载星度指南下载审查指南PDF ) 完成并分析.其中,PCR反应体系为:1×TaqMan@ 通用PCR扩增预混试剂(购自美国应用生物系统公 司),上,下游引物各400nmol/L,荧光标记的2条 TaqMan—MGB探针各200nmol/L,150ngDNA.PCR 反应条件为:先50oC2min;然后95?10min;最后 95?15S,60oC1min,共40个循环. 3.等位基因特异引物定性PCR检测:参见文献 [1].突变基因特异上游引物:5AGCATIq'GGTI'IT AAATI'ATGGAGTATAITr3;上游弓I物:5ATCTAT AGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG3;]游弓I物:5 中华医学杂志2007年9月l1日第87卷第34期 NatlMedJChina,Septemberl1.2007.Vol87.No.34 CTGAATAGTCCTACAGTI'I'I'rCAG,I'I'I'CA3,扩增 产物按本室常规进行电泳,银染.部分标本扩增产 物由上海基康生物技术有限公司在ABI3700DNA 分析仪上完成测序工作. 4.用于定量检测JAK2V617F突变的标准曲线 的制备J:阳性对照HEL细胞的DNA依次用野生 基因型K562细胞的DNA稀释为80%,40%,20%, 10%,5%的比例,每梯度重复3—5管进行扩增,以 其相应的平均ACt(CtJAK2V617F突变一CtJAK2野 生)做6次标准曲线,测试样本的平均ACt代入标 准曲线方程可计算出测试样本的突变基因百分比 (JAK2V617F突变/JAK2总),相关系数均大于 0.99. 5.检测JAK2V617F突变方法的灵敏度测定: 将纯合突变基因型HEL细胞的DNA用野生基因型 K562细胞的DNA依次稀释为2.5%,1.25%, 0.6%,0.3%,0.16%,0.0001%【T/(G+T)l的比 例,按上述相同方法进行检测. 结果 1.JAK2V617F突变在MPD患者的检出率:76 例PV,115例ET,19例MF患者中JAK2V617F突变 bp JAK2V617F 203 12 24O3 表3JAK2V617F突变在各型恶性血液病和正常供者 骨髓中的检出情况(DNA+cDNA) 的检出率分别为70%,51%及58%(表3).其中 168份DNA标本用等位基因特异引物同时进行定 性PCR检测,检测结果的一致率达100%.图1显 示了其中17例的电泳结果.对其中8例标本测序 的结果,与以上两种方法的检测结果一致,图2A一 2F显示了其中6例的测序图.此外,对其中38例 MPD患者的DNA及cDNA标本同时用本方法进行 检测,检测结果一致.上述检测结果表明用实时定 量TaqMan—MGB探针方法可对JAK2V617F突变进 行检测,结果准确. 2.定量PCR检测JAK2V617F突变:定量检测 JAK2V617F突变的标准曲线方程为Y=一0.083x+ M567891011M12131415161718M1920 髫一-_一---; 图1等位基因特异引物定性PCR检测方法验证JAK2V617F突变泳道M为 100,200,300,40O,500,600,700,800,900,1000,1500bp 的DNA标准参考物,泳道18为空白对照,泳道1,2,4,5,7,14,15,16,17,19为扩增出的 203bp的含JAK2V617F突变的条带,其中19, 20分别是阳性对照HEL细胞及阴性对照K562细胞 cc^c^ '. ^c?c^T^cT.cc^c^G^':.^c^T^cTcc^c1^3.G^^^c^T^c1T4.c^c^G^i.?c^T^cTc ({T0? cc^c^6^c^c:oT^cTcc^c:oG^c^c?T^c}o @@ 图2A,2F测序方法验证JAK2V617F突变2A, 2D.JAK2V617F突变阳性标本,在自氨基端第617位氨基酸残 基处可见硷基G及T双峰;2E,2F.JAK2野生型基因型GG,即 阴性标本 避 , 警? 医堂盍7年9月11日第87卷第34期 NatlMedJChina.September11.2007.V0187.N0.34 0.1295,相关系数r=0.999,其中y代表不同的突变 基因百分比,x代表平均ACt(CtJAK2V617F突变一 CtJAK2野生),对上述JAK2V617F突变阳性的MPD 患者的结果根据上述标准曲线计算其突变基因百分 比(JAK2V617F突变/JAK2总),结果平均值为 20.58%?19.33%. 3.定量PCR检测JAK2V617F突变的方法可信 性分析:同一批PCR实验中不同稀释度(阳性对照 HEL细胞的DNA依次用野生基因型K562细胞的 DNA分别稀释为40%,5%,2.5%)做5个平行管, 突变基因T扩增的平均ct值分别为23.57,26.61, 27.60,变异系数分别为1.89%,2.10%,1.93%,野 生基因G扩增的平均ct值分别为26.94,25.43, 25.05,变异系数分别为2.29%,3.60%,1.74%. 不同批PCR实验中不同稀释度(分别为40%, 5%,2.5%)做10批PCR实验,突变基因T扩增的 平均ct值分别为23.17,26.76,27.91,变异系数分 别为2.64%,2.53%,2.69%,野生基因G扩增的平 均ct值分别为26.51,25.76,25.19,变异系数分别 为3.87%,4.17%,1.22%.TaqMan—MGB探针检测 JAK2V617F突变的灵敏度测定结果,在2.5%, 1.25%,0.6%梯度均可检出基因型G和T的扩增 曲线,表明本方法的检测灵敏度可达0.6%. 讨论 虽然发现MPD这种疾病有近100年的历史,但 其病因仍然不十分清楚,I临床没有可称为金标准的 诊断方法,也没有公认的最佳治疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 .近一年 来,有关MPD发病机理研究的主要进展是发现 80%左右PV,50%左右IMF和50%左右ET患者 JAK2基因中存在一个点突变,导致617位氨基酸残 基由缬氨酸(V)变为苯丙氨酸(F).我们利用 TaqMan—MGB探针对374份(其中MPD患者248 例)骨髓或外周血标本进行了检测,该突变的检出 率,与国外文献报道的西方患者的结果相近.其中 168份DNA标本用等位基因特异引物同时进行定性 PCR检测,检测结果的一致率达100%,对其中8例标 本测序的结果,与以上两种方法的检测结果一致. 我们根据野生型JAK2激酶基因及其 JAK2V617F突变基因的反向互补序列设计2条 TaqMan—MGB探针,探针的5端分别标记报告荧光 基团FAM(蓝色荧光)和VIC(绿色荧光),这对探 针可分别与我们设计的JAK2的基因组基因及 eDNA上的引物对一起在一管中完成对野生型 JAK2激酶基因及其JAK2V617F突变基因的扩增鉴 定.本组对38例患者的DNA及其eDNA标本同时 进行了检测,定性检测结果是一致的. 利用报告荧光基团FAM和VIC分别标记野生 型及突变型JAK2激酶基因,实现2条TaqMan—MGB探 针在一管中分别扩增仅一个硷基差别的野生型及突变 型JAK2激酶基因,充分利用了TaqMan—MGB探针更强 的序列特异性的特点,简化了实验步骤,实验结果准 确,且既能对DNA也能对eDNA标本进行检测. 我们进一步检测JAK2V617F突变基因百分比 (JAK2V617F突变/JAK2总),结果平均值为 20.58%?19.33%.重复做上述标准曲线6次,每 次相关系数均大于0.99.同一批及不同批PCR实 验中不同稀释度的突变基因及野生基因扩增的平均 ct值的变异系数均小于5%.这说明利用TaqMan— MGB探针检测JAK2V617F突变是一种快速,可靠 的方法,且可进一步提供突变基因与野生基因的比 值,为疗效观察,微小残留病的动态观察提供依据, 将在MPD诊断及白血病鉴别诊断中发挥重要作用. 参考文献 『1]BaxterEJ,ScottLM,CampbellPJ.eta1.CancerGenome Project,AcquiredmutationofthetyrosinekinaseJAK2inhuman myeloproliferativedisorders.Lancet,2005,365:l054一l061. 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