氨基酸薄层层析 实验
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姓 名:
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专业年级:
组 别:
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称 氨基酸的薄层层析
实验日期 实验地点
合作者 指导老师
评分 教师签名 批改日期 一、实验目的
1.1.掌握薄层层析法的一般原理。
1.2.掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。
1.3.掌握如何根据移动速率(Rf值)来鉴定被分离的物质(即氨基酸混合液)。 二、实验原理
2.1.薄层层析法是色谱分析技术的一种
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。(即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来)。
2.2.氨基酸与茚三酮的显色反应
茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
2.3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值来
表
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示。
层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率(Rf值)也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。(Rf=斑点至原点距离/溶剂前缘至原点距离) 三、材料与方法:
3.1.实验材料:
3.1.1.实验试剂:?分析样品:氨基酸混合液;?吸附剂:硅胶;?粘合剂: 0.5%的羧甲基纤维素钠;?氨基酸的异丙醇溶液;?丙氨酸、精氨酸、甘氨酸;?展开-显色剂(正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液)
3.1.2.实验器材:?层析板、尺子、铅笔;?烧杯、玻棒、量筒;?吹风机;?毛细管、层析缸;?药匙;?烘箱
3.2.实验步骤:
处理与结果分析 点样 层析 显色 制板
3.2.1.制板:?调浆:称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状;?涂布:取洁净的干燥玻璃板均匀涂层;?干燥:将玻璃板水平放置，室温下自然凉干;?活化:70?烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。
3.2.2.点样:?位置:用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm;?取样:用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm;?点样:点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过2mm。
3.2.3.层析和显色:将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85?下烘干，即可显出各层斑点。
3.2.4.处理和结果分析:小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的Rf值。根据Rf值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。
3.3.注意事项:?切勿用手直接接触薄层板面;?点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴;?样品量太少，有的成分不易显示;样品量太多，易造成 斑点过大，
互相交叉或拖尾。
四、结果与讨论:
4.1.实验结果
4.1.1氨基酸的薄层层析实验结果
样品 斑点-原点 溶剂前缘-原点 Rf值
Arg 2.4cm 5.4cm 0.44 Gly 1.1cm 5.4cm 0.20 Ala 3.0cm 5.4cm 0.37 混合液A 2.5cm 5.4cm 0.46 混合液B 2.1cm 5.4cm 0.39 混合液C 1.3cm 5.4cm 0.24
图一 失败品(左) 和层析板(右) 图二 实验后结果
4.1.2.实验现象:
?第一次制板过程中，将糊状物均匀倒到洁净玻璃板中央部分，用药匙均匀涂满玻
璃板，用手左右上下将其摇晃后，糊状物在大部分地方均匀形成涂层，但在其中一侧形
成水纹样，无论如何摇晃无法去除;而在第二次制板过程中，重复以上步骤后，糊状物
均匀的在玻璃板上形成涂层。(如图一)
?点样后，溶液逐渐干燥，不能明显看清斑点。层析约30min后溶剂前缘达到层析板的1/2左右，前缘大约形成一条直线，用铅笔和直尺轻轻描绘出这一条线。利用烤箱烤干后，层析板上出现6个红紫色斑点。(如图二)用直尺和铅
笔记
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录斑点至原点距离和溶剂前缘至原点距离。
4.2.结果讨论与误差分析
?第一次制作的层析板之所以会出现水纹样，可能是因为在搅拌混匀的过程中没有混匀，也可能是因为玻璃板事先被弄脏了，所以无论如何摇动无法去除水纹样。再次制作的时候，我们仔细快速搅拌了混合物，并重新清洗擦拭了玻璃板，所以没有出现这种状况。所以制作层析板的时候，应该注意玻璃板是否干净，并在制作混合物的时候注意一定要快速的将混合物搅拌均匀。
?层析后的层析板上出现了近乎平行的溶剂前缘线，是因为层析板制作的涂层足够均匀而形成的。
?用烤箱烤干层析板后显色，出现了六个点，其中，在混合物的那一列中出现了三个不同的点。记录实验数据后测量Rf值，根据实验数据，可以粗略的认为，在一定的系统误差和实验误差的允许的情况下，混合液中含有丙氨酸、精氨酸和甘氨酸。
?根据三线图中的数据可以发现，混合点A的Rf值?Arg的Rf值，同样，混合液B的Rf值?Ala的Rf值，且混合液C的Rf值与Gly的Rf值相差甚大，原因可能是层析板内部并不平整所致，也可能是由于在测量过程中测量斑点到原点距离时存在一定的数据误差所致，也有可能是因为实验操作过程中层析时间不足或点样过程中斑点中心不在同一水平面上导致。
4.3.复习思考题
4.3.1.硅胶的吸附力与含水量的问题?
答:硅胶的吸附能力与含水量呈负相关，含水量越高，吸附力越弱。
4.3.2.吸附实验中吸附剂的选择根据?
答:根据本次实验的特点，吸附剂的选择有如下依据:?吸附剂应有足够大的表面积和吸附能力;?吸附剂和不同的氨基酸结合应有不同的吸附能力;?吸附剂与溶剂和样品均不会发生化学反应;?吸附剂所形成的的颗粒均分，不会破碎。?吸附剂应为酸性或中性，因为样品为氨基酸。
4.3.3.氨基酸纸层析，两者有何区别?
答:?支持物:纸层析不必铺板，其滤纸为支持物;薄层层析利用硅胶铺板制作层析板。?固定相:纸层析为水;薄层层析为硅胶。?层析方向:纸层析为水平型;薄层层析为垂直型。?吸附性:纸层析较弱;薄层层析较强。?展开剂:纸层析所选用的展开剂极性较强;薄层层析的极性一般。?结果准确性:纸层析能够粗略且快速确定组分;薄层层析速度较慢但组分确定结果精准。
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