总糖的测定蒽酮比色法
实验五 总糖的测定——蒽酮比色法
一、目的:
1.掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
2.学习植物可溶性糖的一种提取方法。
二、原理:
糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(CHO)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸1410
收，在150 µg/ml范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30 µg左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器:电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等
2.试剂:
(1)葡萄糖标准液:l00 µg/ml
(2)浓硫酸
(3)蒽酮试剂:0.2 g蒽酮溶于100 ml浓 HSO中。当日配制使用。 24
3.材料:甜糜秸秆
四、操作步骤
1.葡萄糖标准曲线的制作
取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液:
管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8
蒸馏水(ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量(µg) 0 10 20 30 40 60 80
在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0 min取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量(µg)为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。
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2.植物样品中可溶性糖的提取:
将样品剪碎至2 mm以下，105 ºC烘干至恒重，精确称取1~5 g，置于50 ml三角瓶中，加沸水25 m1，加盖，超声提取10 min，冷却后过滤(抽滤)，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤(抽滤)，滤液收集在50 m1容量瓶中，定容至刻度，得提取液。
3.稀释:吸取提取液2 m1，置于另一50 m1容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀。
4.测定
吸取1 ml已稀释的提取液于试管中，加入4.O ml蒽酮试剂，平行三份;空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A平均值在标620准曲线上查出葡萄糖的含量(µg)。
五、结果处理
C × V × D 总
%)= ????????????? × 100 样品含糖量(
6 W × V × 10 测
其中:C——在标准曲线上查出的糖含量(µg)，
V——提取液总体积(ml)， 总
V——测定时取用体积(ml)， 测
D——稀释倍数，
W——样品重量(g)，
610——样品重量单位由g换算成µg的倍数
六、注意事项:
该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应)，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。
七、思考题:
1.用水提取的糖类有哪些,
2.制作标准曲线时应注意哪些问题,
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