鲤鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白提取工艺的应用

鲤鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白提取工艺的应用 鲤鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白提取工艺的应用 第15卷第4期淮海工学院(自然科学版) 2006年12月JournalofHuaihaiInstituteofTechnology(NaturalSciencesEd— itio — n) Vo1.15No.4 Dec.2006 6685(2006)04—0055—04 文章编号:1672— 鲤鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白提取工艺的应用 张俊杰,段蕊,潘秀楼 (淮海工学院海洋学院,江苏连云港222005) 摘要;主要研究酶法提取鲤鱼鱼鳞胶原蛋白过程中各种因素的影响,并在单因素实验的基础上, 以SAS对影响因素进行了综合分析,得到了鲤鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白提取的最佳条件,温度为 l6.59?,时间为28.18h,酶用量为396.21u/g,为淡水鱼综合加工利用提供了理论依据. 关键词:鱼鳞;SAS;胶原蛋白;提取 中图分类号:TS254.9文献标识码;A StudyontheExtractionofEnzyme.solventCollagenfromFishScale ZHANGJun-jie,DUANRui,PANXiu—lou (CollegeofMarineScience,HuaihaiInstituteofTechnology.Lianyungang222005,China) Abstract:UtilizationofSASontheextractionofcollagenfromfishscalebasedonthestudiedo f singleeffectingfactorswereconducted.Theoptimumconditionsofextractionwereobtained as follows:thetemperatureof16.59?,thetimespanOf28.18h,andtheenzymeuselevelof 396.21u/g.Suchastudycanprovidetheoreticalreferenceforthecomprehensiveutilizationof freshwaterfish. Keywords:fishscale;SAS;collagen;extraction 0引言 鱼鳞是鱼类真皮层的变形物,占鱼体总质量的 2,5.鱼鳞中有机物占41,7O,无机质占 3O9,6,6O9,6,存在最多的物质是蛋白质,其中又以胶 原蛋白和硬蛋白为主. 从组织中提取胶原蛋白,根据提取体系的不同, 大体上可以分为中性盐可溶性胶原蛋白和酸性可溶 性胶原蛋白.胶原蛋白的变性温度在中性时一般为 40~41?,酸性时为38,39?[1],因此,操作最好 在低温下进行.目前制备胶原蛋白最常用的试剂是 中性盐溶液和酸性溶液,中性盐溶液一般为NaC1 溶液,酸性溶液多采用0.05,0.15mol/L的醋酸, 现在多数情况下先用0.15mol/LNaC1溶液与组织 反复匀浆,去除盐溶性的肌肉蛋白,再用提取刺进行 抽提. 对于难以溶解的胶原蛋白,通常采用加人蛋白 酶的方法促进胶原蛋白纤维的溶解口],即在未变性 的条件下,将胶原蛋白暴露在蛋白水解酶中.胃蛋 白酶是最普遍使用的一种酶,利用它对胶原蛋白有 限的水解达到提高得率的目的.胃蛋白酶只是对胶 原蛋白的非螺旋区域起作用,对螺旋区不进行水解, 作用方式如图1所示啪. 胃蛋白酶只是对胶原蛋白进行有限水解,水解 增大了胶原蛋白的溶解度,因此,采用胃蛋白酶制备 胶原是目前应用效果比较好的一种方法. 由于鱼鳞具有异常紧密的纤维组织,匀浆困难, 收稿日期:2006—05—15}修订日期t2006一n一14 基金项目;淮海工学院自然科学基金资助项目(Z2005020) 作者简介;张俊杰(1970一)'男,河北保定人.淮海工学院海洋学院副教授,博士,主要 从事水产品综合加工利用方面的研究.(E-mail) zjjdrl80@yahoo.corn.cn 56淮海工学院(自然科学版)2006年12月 本研究首先用0.15mol/LNaC1溶液对鱼鳞进行浸 泡处理,再在醋酸条件下,蛋白酶水解提取. l Pepsinll 图1胃蛋白酶对胶原蛋白的作用方式 Fig.1Modelofpepsinactiononcollagen 1材料与方法 1.1材料与设备 鲤鱼鱼鳞:来自本地市场,经清洗,晾干备用. 胃蛋白酶:SigmaP7000. BP221S(赛多利斯)电子天平(北京赛多利斯仪 器系统有限公司),HW.YS型电子恒温水浴锅(浙 江舟山市定海区海源仪器厂),UV一754紫外一可见分 光光度计(山东高密彩虹分析仪器有限公司),SH2一 D循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂). 1.2方法 1.2.1酶法提取鱼鳞胶原蛋白的工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 鱼鳞 一O.5mol/LEDTA脱钙一O.15mol/LNaC1浸泡 一抽滤一蒸馏水清洗一以质量比1:1O的比例加入 0.5mol/L冰乙酸和胃蛋白酶提取一测蛋白质得率. 1.2.2鱼鳞中蛋白质的测定双缩脲比色法[4]:单 因素实验中测定胶原蛋白的浓度.紫外吸收A.和 A比值法测蛋白浓度c3]:在响应面分析过程中测 定蛋白质浓度. 1.2.3酶溶性胶原(PSC)提取温度的选择精确 称取5g鱼鳞4份,按"1.2.1"的方法处理后,以质 量比1:10加入o.5mol/L乙酸和胃蛋白酶(300u/ g)进行提取,分别在5,1O,15,2O?的温度下,以双 缩脲法测定不同时间蛋白质的溶出量,确定提取温 度的范围. 1.2.4酶用量的选择精确称取5g鱼鳞3份,按 "1.2.1"的方法处理后,在其它操作相同的情况下, 每克鳞干重分别加入150,300,450u胃蛋白酶在2O ?进行提取,以双缩脲法测定不同时间蛋白质的溶 出量,确定酶的用量范围. 1.2.5酶溶性胶原(PSC)提取时间的选择精确 称取5g鱼鳞,按"1.2.1"的方法处理后,按质量比1 :1O的比例加入o.5mol/L乙酸和300u/g(鱼鳞干 重)胃蛋白酶进行提取,在2O?的温度下,测定不同 时间蛋白质和羟基脯氨酸的溶出量,直到溶出的蛋 白质和羟基脯氨酸不再增加或增加量较小为止,确 定提取胶原的时间. 1.2.6响应面分析实验对影响胶原蛋白提取率 的因素(提取度,提取时间,酶用量)进行响应面实 验,因子水平安排见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1,用"1.2.2"的方法测定蛋 白浓度,并用蛋白质浓度和溶液体积的乘积除以鱼 鳞质量,得到鱼鳞胶原蛋白的提取率. 裹1不同因子水平裹 Table1Responsesurfaceanalysisofdifferent levelsofeffectingfactors 水平值温度(X1)/?时间(X2)/h酶用量(x3)/(u/g) 2结果与分析 2.1双缩脲比色法 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线绘制 取6支比色管分别加入标准明胶溶液(5rag/ mL)0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0mL,然后依次加入 2.0,1.6,1.2,0.8,0.4,0mL蒸馏水,再加双缩脲试 剂4.0mL至各比色管中,摇匀后在15,25?恒温 水浴30rain.用754分光光度计在540nm下测定 吸光度,制作标准曲线,以蛋白质质量浓度ID为横坐 标(单位mg/mL),以吸光度A为纵坐标,并计算求 出线性回归方程,结果如图2所示. 蛋白质质量浓度/(mg/mL) 图2双缩脲测定蛋白质标准曲线 Fig.2Standardcurveofgelatinsample 经过计算得标准曲线方程: 第4期张俊杰等:鲤鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白提取工艺的应用57 A一0.0641o一0?0246, 相关系数r=0.999,线性关系显着. 2.2酶溶性胶原提取温度的选择 按"1.2.3"的方法选择5,10,l5,20?作为酶溶 性胶原蛋白提取的实验温度,分别在不同时间测定 蛋白质的质量浓度,结果如表2所示. 表2不同温度提取得到酶溶性胶原的质量浓度 Table2Concentrationsofcollagenextractedat differenttemperatures 由表中数据可以明显看出,对于酶的作用温度, 很显然是温度越高,其作用的速度越快,得到蛋白质 的浓度越高.由于在蛋白质变性温度的测定中知道 鱼鳞胶原的变性温度大约在27?,为了减少蛋白变 性的可能,一般不选择超过20?的条件,因此对于 酶溶性胶原,在SAS实验中,选用了10,15,20?3 个条件. 2.3酶用量的选择 按"1.2.4"方法,在20?下采用150,300,450 u/g酶用量,在2,4,8,24,48,72h分别测定胶原蛋 白的质量浓度,结果如图3所示. 20 童15 葵IO 5 鬟. 图3在不同酶用量时提取液中胶原蛋白的质量浓度 Fig.3Concentrationofcollagenusingdifferent amountofenzyme 由图3中数据可以看出,酶的用量对蛋白质的 析出影响非常显着,随着酶用量的增加,蛋白质的质 量浓度非常明显地增加,因此加入胃蛋白酶对提高 胶原的提取率有非常显着的影响.胶原在未变性的 条件下,不容易被蛋白酶水解,又由于鱼鳞胶原是与 鱼鳞硬蛋白复合在一起,就更增加了酶作用的难度, 所以对胶原或胶原蛋白的提取一般采用胃蛋白酶比 较多,胃蛋白酶对胶原水解集中在非螺旋区域,对紧 密的螺旋区域作用不大,这样既增大胶原在酸性条 件下的溶出量和溶出速度,又不会破坏胶原的三螺 旋结构. 由图3中的数据可以看出,蛋白酶的用量在 150u/g时,蛋白的溶出量最小,随着酶用量的加 大,蛋白质质量浓度加大,但在48h之后,300u/g 蛋白酶对胶原的提取反而大于450u/g,同时考虑到 提取的成本以及得到胶原后期的纯化问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,在选择 酶浓度时以300u/g为好,在SAS实验中,也选择 300u/g的条件作为中心点. 2.4酶溶性胶原(PSC)提取时间的选择 按"l-2.5"的方法,20?,300u/g酶添加量下, 在24,48,72,96h分别测定胶原的质量浓度,结果 如表3所示. 衰3不同提取时间胶原质量浓度的变化 Table3Changesofconcentrationof collagenindifferenttime 时间/h24487296 胶原质量浓度/(mg/mL)3.3476.42812.59213.376 选择300u/g的加酶量,测定不同时间提取液 中蛋白的质量浓度,由表3中的数据可以看出,随着 时间的延长,蛋白质的质量浓度快速增加,尤其在 48h到72h增加较多.72h以后,由于提取液中胶 原蛋白的浓度比较高,提取液变得很粘稠,阻止了酶 与底物的进一步接触和胶原蛋白的溶出,所以再增 加24h,胶原蛋白质量浓度增加不大,因此对于每次 提取的时间不应高于72h,对于SAS也以72h为上 限进行分析. 2.5响应面实验结果 对影响提取的因素(提取温度,提取时间,酶用 量)进行响应面实验.按"1.2.5"的方法进行实验, 结果见表4. 15个实验点可分为两类,其一是析因点,自变 量取值在X,X.,X所构成的三维顶点,共有12个 析因点,其二是零点,为区域的中心点,零点试验重 复3次,用以估计实验误差.以得率为响应值,经回 归拟合后,各实验因子对响应值的影响可以用下列 函数表示: y=口0+lXl+"2X2+"3X3+ ?l1X1.+"22X2+铂3X3.+ 58淮海工学院(自然科学版)2006年l2月 口l2XlX2+.l3XlX3+口23XzX3 衰4响应面试验结果 Table4Resultsofresponsesurfaceanalysis 运用SAS'RSREG程序对15个实验点的响应 值进行回归分析,分别得到如表5和表6所示的分 析结果. 用回归方程描述各因子与响应值之间的关系 时,其因变量与全体自变量之间的线性关系显着,F >F0?(9,5),线性相关系数r一0.92153132,方差 分析数据看出,可以进行响应面分析. 将回归方程取一阶偏导数等于零并整理得 0.521250+0.09575X1+0.456750X2— 0.272250X3:0, 一 0.329500—0.2365X2+0.45675OX1— 0.017625X3:O, 0.225000—0.23825X一0.272250X1— 0.017625X2一O, 解得X1—0.3186l1813,X2=一0.82570207,X3 =0.641387184,即温度为16.59?,时间为28.18 h,酶用量为396.21u/g. 衰5回归系数取值 Table5RegressioncoefficientofSAS'RSREG 裹6回归方程的方差分析 Table6Varianceanalysisofregressionequation 注lF0.06(9.5)=4.77. 3结论 通过单因素实验可以确定鱼鳞胶原蛋白提取因 素中提取温度,提取时间,酶用量3个因素的适用范 围,然后利用响应面分析实验,最终确定鲤鱼鱼鳞中 酶溶性胶原蛋白的最佳提取因素:温度为l6.59?, 时间为28.18h,酶用量为396.21u/g 参考文献: E1-]顾其胜,蒋丽霞.胶原蛋白与临床医学[M7.上海:第二 军医大学出版社,2003:10—15. 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