【doc】中华蚱蜢精子发生过程中花生凝集素受体的分布与变化

【doc】中华蚱蜢精子发生过程中花生凝集素受体的分布与变化 中华蚱蜢精子发生过程中花生凝集素受体 的分布与变化 动物学杂志ChineseJournalofZoology2006,41(1):7—11 中华蚱蜢精子发生过程中花生凝集素 受体的分布与变化 欧阳霞辉??奚耕思? (?陕西师范大学生命科学学院西安710062;?西北民族大学生命科学与 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院兰州730030) 摘要:采用生物素标记的花生凝集素(PNA)对中华蚱蜢(Acridacinerea)精子发生过程中细胞质膜的糖蛋 白(含有糖基Ga1.(1,3).GalNAC)进行了标记,旨在认识精子发生过程中细胞质膜糖复合物的形成与变 化规律,探讨其所具有的功能.结果表明,在中华蚱蜢的精子发生中,精母细胞能够自身合成PNA受体; 精子细胞到成熟精子时期生精细胞质膜糖复合物发生了明显的修饰变化,这些变化与精子获得及卵子 进行识别,粘附,结合等受精能力密切相关. 关键词:中华蚱蜢;精子发生;糖蛋白;PNA 中图分类号:Q492文献标识码:A文章编号:0250.3263(2006)01.07.05 DistributionandChangesofPNA—bindingGlycoconjugatesduring SpermatogenesisofAcridacinerea OUYANGXia.Hui??XIGeng.Si? (?LifeScienceCollege,ShaanxiNormalUniversity,Xian710062; ? CollegeofLifeScienceandEngineering,NorthwestUniversityforNationality,Lanzlwu730 030.China) Abstract:ThedistributionofPNA— bindingglycoconjugatesontheplasmamembraneoftestictilargermcellsduring spermatogenesisofAcridacinereawasdetectedbyusingbiotin— labeledPNA.Intestis.PNAreceptorswerefirstly observedinthecytoplasmandontheplasmamembraneofprimaryspermatocyte,greatlyincreasedontheplasma membraneofsecondaryspermatocyte,andthendecreasedandaccumulatedinthetailoftransformingspermatid.The reactionwasalsoobservedinspermatozoaandspermatheca,withstrongerstainingintheheadandweakerstainingin thetail.Auniversalstainingpatternwasobservedontheplasmamembraneofspermcystcells.Theresultssuggest thatPNAreceptorsaresynthesizedbyspermatogeneticcellsatearlyperiodandgreatlymodifiedduring spermatogenesis,whichissimilartothechangesinotherinsectsandmammals. Keywords:Acridacinerea;Spermatogenesis;Glycoconjugates;PNA 凝集素受体是指细胞表面的以糖蛋白或糖 脂形式存在的糖复合物,它们是细胞间通信的 重要信号分子,糖链的糖基组成和排列顺序,分 枝形式以及糖链的长短构成了化学信号传递着 生物信息….动物的精子和卵子是两类结构及 功能均十分特化的细胞,其膜表面存在着多种 凝集素受体,它们在配子发生,精卵识别与融合 以及受精完成后防止多精穿入的皮层反应等过 程中起着重要作用.近年来,借助凝集素能 与糖复合物专一结合的特性,采用多种标记方 法,对多种哺乳动物精子发生及成熟过程中的 基金项目陕西省自然科学基金(No.2000SM22); *通讯作者,E-mail:xigengsi@snnu.edu.cn; 第一作者介绍欧阳霞辉,女,博士研究生;研究方向:昆虫生 殖与发育;E-mail:oyxhui316@126.com. 收稿El期:2005—05-31,修回日期:2005.11-21 ? 8?动物学杂志ChineseJournalofZoo/ogy 细胞表面凝集素受体研究表明,精子表面的糖 复合物出现于精子的发生阶段,在成熟的过程 中会发生明显的修饰,并且体外或体内获能时 仍有某种程度的改变.有关昆虫精子表面糖复 合物的研究也有不少报道_3],但能够比较系统 的对昆虫精子发生与形成过程中部分表面糖复 合物分布变化的研究仍未见有报道. 本文采用生物素标记的花生凝集素(PNA) 对中华蚱蜢(Acndacinerea)精子发生与形成过 程中细胞表面糖复合物变化进行了较为系统的 观察,并对精巢中和受精囊中的精子表面糖复 合物进行了比较,旨在了解其变化规律,对其相 应的功能进行一定的探讨. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1实验材料实验以直翅目(Orthoptera)剑 角蝗科(Acrididae)中华蚱蜢为研究对象,标本 分别于2002年8,10月中旬采自陕西省西安 市南郊,虫龄为若虫和各期成虫.采回后立即 在生理盐水中解剖,分别取出精巢和受精囊,置 Bouin'8液固定,常规石蜡切片,厚8m. 1.2凝集素细胞化学 1.2.1凝集素实验所用生物素标记的花生 凝集素购自美国Sigma化学公司,PNA特异结 合的糖为半乳糖G(1,3)半乳糖酰胺,生物素标 记的PNA工作液浓度为25/~g/ml. 1.2.2实验过程主要原理是:首先使生物素 标记的凝集素与组织切片上的凝集素受体结 合,然后滴加辣根过氧化物酶标记的抗生物素 蛋白亲和素(HRP.Streptavidin),使之与生物素 结合,通过使标记物显色而显示凝集素受体的 所在部位.流程:石蜡切片,常规脱蜡至水; 0.1%的胰蛋白酶37?消化10min,TBS缓冲液 洗3次,每次5min(以下相同);3%过氧化氢封 闭内源性酶10min,TBS洗3次;滴加生物素标 记的凝集素25/~g/ml,37?60min,TBS洗3次; 滴加辣根过氧化物酶标记的亲和素2g/ml, 37?作用30min,TBS洗3次;DAB.H202显色 后镜检;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶 封片. 对照实验采用两种方法:(1)用TBS取代生 物素标记的PNA工作液;(2)单糖竞争抑制法, 即在PNA工作液中加入0.2mol/LD.半乳糖. 1.3图像分析用HPIA$2100高清晰度彩色 图文分析系统,20倍物镜下对精子发生不同时 期细胞PNA阳性反应的平均灰度(灰度分级为 0,255级,0级为最黑的灰度,255级为最浅 的灰度,灰度值愈小表明染色强度愈强)进行 定量分析,每一发育时期取5张组织切片,每 张切片随机选取6个视野.各组实验数据以平 均值?标准误(Mean?SE)表示,采用SPSS统计 软件进行单因素方差分析(One.WayANOVA). 2结果 2.1精巢中的标记以单个精细小管而言, 在精子发生的整个过程中,从生殖区到转化区, 育精囊细胞膜上始终有不同程度的阳性标记, 整个精细小管呈现出网格状外观(图版I:1,7, 箭头所示);在精原细胞没有发现阳性标记(图 版I:1,箭头所示);而在初级精母细胞的胞质 中可见有一强阳性颗粒(箭头所示),胞膜有较 强阳性标记(图版I:2);次级精母细胞胞质中 无阳性反应,而胞膜有强阳性反应(图版I:3); 在早期精细胞质膜上有较强的阳性反应(图版 I:4),随着精细胞变形,阳性标记逐渐集中在 尾部的某一区域(图版I:5);成熟精子的头部 有强阳性反应,而尾部的标记较弱(图版I:6). 2.2受精囊中的标记受精囊囊壁上皮层分 泌细胞的胞质发现有阳性颗粒存在(图版I: 8);受精囊内的精子尾部质膜表面仅具有弱阳 性反应,而头部有强阳性标记(图版I:9). 2.3对照实验TBS取代PNA工作液的对照 实验结果为阴性(图版I:10);单糖竞争抑制的 对照实验结果也为阴性(图版I:11). 2.4图像分析及统计结果中华蚱蜢精子发 生过程中,不同时期细胞阳性反应的灰度值经 方差齐性检验后进行单因素方差分析,不同字 母上标代表平均值之间具有显着差异(均为尸 <0.05)(表1). 1期欧阳霞辉等:中华蚱蜢精子发生过程中花生凝集素受体的分布与变化'9' 表1中华蚱蜢精子发生不同时期PNA受体阳性反应程度(n=30) Table1ThedegreeofPNAreceptorpositivereactionindifferentperiodsinoogenesisofAcrid ac~rea 灰度值Grayvalue 精原细胞Spermatogonium 初级精母细胞Primaryspermatocyte细胞质Cytoplasm 细胞膜Cellmembrane 次级精母细胞Secondaryspermatocyte细胞膜Ceilmembrane 变形期精细胞Elongatingespermatid 精细胞Spermatid 精巢内精子Spermintestis头部Head 育精囊Spermcyst 受精囊上皮Spermathecaepithelium 受精囊内精子Sperminspermatheca头部Head negaUve lo6.33'?3.48 125.33?1.45 103.67'?3.92 138.o0?1.73 l60.33?3.04 120.33?1.45 134.67?3.75 133.o0?3.O5 121.67?1.73 单因素方差分析,不同上标的平均值之间的差异显着,P<O.05. One—WayANOVA.Meanswithdifferentsuperscriptsarestatisticallydifferent,P<0.05 3分析与讨论 实验结果表明,在中华蚱蜢的精子发生中, 初级精母细胞以上的生精细胞均有半乳糖一B一 (1,3).半乳糖酰胺的分布,随着精子发生的进 行,其分布呈现出规律性的变化(表1).在初 级精母细胞胞质中有一强阳性颗粒,质膜呈较 强阳性标记;而在次级精母细胞,胞质中无阳性 反应,但质膜呈强阳性反应,由此推测,PNA受 体可能首先是由初级精母细胞合成,然后转移 到质膜上,在次级精母细胞,由于量的积累其质 膜出现了强阳性标记.而在该时期,PNA受体 的大量表达可能意味着它与生精细胞的分化和 发育有关.有人用单克隆抗体在小鼠精母细胞 表面检测到一种分子量为95ku的WGA受体, 在腹膜内注射单克隆抗体明显引起小鼠精子发 生的紊乱,说明这种WGA受体在精子发生的 早期减数分裂前期起重要作用HJ.由此可见, 凝集素受体对于精子发生的准确完成非常重 要. 在中华蚱蜢的精子细胞中,PNA标记随着 精子细胞变形发生了明显变化.在早期精子细 胞,PNA受体存在于局部细胞膜上,阳性反应程 度略低于精母细胞,推测可能是由于细胞分裂 引起量的变化.随着精子细胞变形,阳性反应 逐渐集中在尾部的某一区域;成熟精子头部的 阳性反应较强,但尾部标记较弱,而且受精囊内 与精巢内的精子表面的标记是相同的.可见, 精子在变形及成熟过程中质膜PNA受体糖蛋 白发生了修饰,这种修饰作用在精巢内就已完 成,而受精囊壁上皮层分泌细胞胞质中的PNA 受体可能与保藏精子有关.哺乳动物的精子成 熟中生精细胞质膜糖蛋白的修饰机制已比较明 确,有关昆虫生精细胞质膜糖蛋白的修饰机制 目前并不清楚.中华蚱蜢精子细胞变形中尾部 存在的PNA受体可能来源于周围细胞,结合在 尾部可能与精子的直线运动有关.根据成熟 精子头部出现强阳性反应,推测PNA受体可能 与卵子的识别与融合有关,这在双翅目昆虫 Mosquitoculex有相似的结果,实验也证明人 类精子表面的PNA受体能够增加膜的渗透性, 引发顶体反应,而且顶体反应前后PNA受体 发生了明显变化. 育精囊细胞质膜的阳性反应说明它们在整 个精子发生过程中可能具有类似于脊椎动物支 持细胞的作用.在哺乳类的精子发生中,生精 细胞与支持细胞之间形成的血睾屏障有利于保 证生精细管内环境的稳定性,避免机体免疫反 应对精子发生的破坏.糖复合物在精子发生 过程生精细胞与支持细胞的粘附中有重要作 用,一种形成N连接多糖的甘露糖苷酶?X的 无效,导致N连接糖复合物不能形成,引起支 持细胞与生殖细胞的粘附失败,生殖细胞早熟 导致雄性不育,说明特异的糖复合物对于精子 ? 1O?动物学杂志ChineseJournalofZoo/ogy4l卷 发生是必需的.有关育精囊细胞质膜PNA 受体的功能还有待进一步的研究. 由以上可知,花生凝集素受体在中华蚱蜢 的精子发生中呈现出规律性的变化,这种变化 与蟋蟀和哺乳动物的比较有相似之处,尤其在 精子发生至次级精母细胞阶段差异较小?.'"J. 由此表明,不同动物精子表面糖复合物的合成 和分布遵循一定的规律,这种变化规律除了与 种的特异性有关外,更重要的是与其生理功能 密切相关.凝集素受体在受精过程中的作用, 在昆虫研究的比较少,要详细地阐明精卵表面 各种糖复合物的具体作用和功能,还需进一步 广泛深入地研究. 参考文献 [2] [3] [4] 陈晓萍.糖复合物的生物信息作用.自然杂志,2001,23 (5):270—272. 李中奎,何成强,李云龙.糖复合物与发育.生命的化 学,2001,21(5):391—393. 奚耕思,杨月红,郑哲民.蟋蟀精子表面LCA及ConA结 合糖复合物的分布变化.动物,2002,鹌(1):125 130. 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