荧光定量PCR
2.4 荧光定量PCR
2.4.1使用Aza及TSA处理体外培养的细胞
取同批次细胞进行实验分组:对照组为同期不加药的细胞;实验组:?Aza组:加2µM的Aza培养96h;?TSA组:加0.3µM的TSA培养24h;?联合组:加2µM的Aza培养72h后再加0.3µM 的TSA继续培养24h。Aza处理的实验组每隔24h更换一次培养基。
2.4.2 细胞总RNA提取
(1) 细胞长势良好且达到90%左右时,真空吸去培养基,PBS清洗一次; (2) 加入1ml/孔的Trizol,吹匀,转移至新的1.5ml EP管中; (3) 转至细胞房外,冰上放置5min,防止RNA降解; (4) 加入200µl氯仿,剧烈振荡15s,室温放置3min;
(5) 4?,12000g离心15min;
(6) 将上层水相中的RNA(约500µl)转移至新的EP管中,加入500µl异丙
醇,混匀并室温置10min;
(7) 4?,12000g离心15min,移去上清;
(8) 加1ml 75%乙醇(DEPC)沉淀RNA,4?,7500g离心5min,弃上清; (9) 室温放置5-10min,加入50µl DEPC水,混匀,取适量进行1%琼脂糖凝
胶电泳验证完整度,并测定其浓度,剩余的于-80?保存备用。 2.4.3 RT-PCR
(1)按照表2-4所示将各成分加入RNase free的PCR反应管中,65?作用5min; (2)取出PCR反应管,立即置于冰水混合物上,随后分别加入表2-5所示的各成分;
表2-4 RT-PCR反应的成分及用量(?)
成分 单管用量
随机引物(50µM) 1µl
RNA(2µg) 1µl
dNTP(2.5mM) 4µl
ddHO 6µl 2
总计 12µl
表2-5 RT-PCR反应的成分及用量(?)
成分 单管用量
5×First-Strand Buffer 4µl
0.1M DTT 2µl
RRI 1µl
(3)37?作用2min;
(4)加入1µl M-MLV RT(200U),轻柔混匀;
(5)25? 10min,37? 50min,70? 15min,4?保存;
(6)将反转录得到的cDNA保存于-20?备用。
2.4.4 荧光定量PCR方法分析药物干预前后RSPO-3在结直肠癌细胞中的转录情况
以反转录的cDNA为
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进行荧光定量PCR反应,同时以GAPDH基因作为内参。RSPO-3和GAPDH基因引物由上海Invitrogen合成(表2-6)。PCR反应条件:95? 2min 预变性后开始40个循环:95? 15s 、60? 30s、68? 30s,最后95? 15s、60? 1min、95? 15s、60? 15s进行熔解曲线的扩增。将目的基因与GAPDH的比值作为其mRNA水平的相对值。每个细胞重复实验3次。mRNA表达水平取其平均值进行统计分析。将20×SYBR solution和2.5×RealMasterMix在室温下平衡,加125µl 20×SYBR solution至1.0ml 2.5×RealMasterMix中并混匀,按照表2-7所示将各成分加入PCR管中并进行荧光定量PCR反应。
表2-6 RSPO-3和GAPDH基因引物序列
名称 序列
5' ACGGATTTGGTCGTATTGGGC 3'
GAPDH
5' CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT 3'
5' ATGCAATTGCGACTGCTTTCTCTGT
RSPO-3
5'CGGTGAGGCTACAGTGTAACAGTGT3'
表2-7 荧光定量PCR反应的成分及用量
单管用量 成分
9µl 2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution
0.5µl 正向引物(1µM)
0.5µl 反向引物(1µM)
9µl 模板(cDNA)
1µlddHO 2
20µl 总计
2.4.5 荧光定量PCR数据分析方法
-Ct??本实验结果采用2相对定量分析法,并以GAPDH基因作为内参基因来计算转录的相对差异。其具体计算程序为:?计算每种细胞经药物处理后的?Ct值:?Ct=Ct-Ct;?计算出??Ct值:??Ct=?Ct-?Ct目的基因内参基因目的基因
-Ct??;?计算相对差值2即不同细胞中经药物处理后的RSPO-3基因在阴性对照
相对于对照组的表达差异。