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植物组织培养技术
山东省昌乐二中
高二级生物
赵金龙
绪论
教学目的与要求
1．掌握组织培养的概念和培养的类型
2．掌握组织培养的特点
3．一般掌握组织培养发展历史
4．初步掌握组织培养在农业实践上的应用
教学重点与难点
植物组织培养的概念；植物组织培养技术和理论基础
一、组织培养的概念
高等植物的组织培养(tissue culture)技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。
二、组织培养的类型
组织培养按培养对象可分为：
1.植株培养(plant culture)
2.器官培养(organ culture)
3.组织或愈伤组织培养(tissue or callus culture)
为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。
4.细胞培养 (cell culture )
5.原生质体培养(proplast culture )
是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。
三、植物组织培养的基本理论
（一）植物细胞的全能性
植物组织培养的理论依据是细胞全能性。
所谓细胞全能性就是指植物体的任何一个有完整细胞核的活细胞都具有该种植物的全套遗传信息和发育成完整植株的潜在能力。
植物细胞的全能性是潜在的，要实现植物细胞的全能性，必须具备一定的条件：
①体细胞与完整植株分离，脱离完整植株的控制；
②创造理想的适于细胞生长和分化的环境，包括营养、激素、光、温、气、湿等因子。（二）植物的再生性
在植物分化根、茎、叶等器官的过程中，某处组织受到一定的损伤，则在受伤部位往往会产生新的器官，长出不定芽和不定根，从而形成新的完整植株。
脱分化：是指成熟细胞或已分化的细胞转变成为分生状态的过程，即诱导成为愈伤组织的过程。
愈伤组织：是指在人工培养基上经诱导后外植体表面上长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
再分化：是指由脱分化的组织或细胞转变为各种不同的细胞类型，由无结构和特定功能的细胞团转变为有结构和特定功能的组织和器官，最终再生成完整植株的过程。
（三）根芽激素理论
根和芽的分根和芽的分化由生长素和细胞分裂素的比值所决定，二者比值高时促进生根；比值低时促进茎芽的分化；比值适中则组织倾向于以一种无结构的方式生长。通过改变培养基中这两类激素的相对浓度可以控制器官的分化。
（四）组培苗遗传稳定性的问题
1、影响组培苗遗传稳定性的因素
（1）基因型
（2）继代次数与继代时间
（3）发生方式
（4）外源激素
2、减少变异，提高遗传稳定性的措施
四、植物组织培养的发展与应用
（一）植物组织培养的发展
（二）植物组织培养的技术特点
1、培养材料经济
2、培养条件可以人为控制
3、生长周期短，繁殖率高
4、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
（三）植物组织培养的应用
1.种苗快速繁殖
2.苗木脱毒
3.培育新品种
4.保存和交换植物种质资源
5.生产植物性药物和生物制品
本章小结
1．植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植株的过程。
2．按照外植体的不同，植物组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。
3．组织培养具有：培养条件可以人为控制；生长周期短；繁殖率高；管理方便；利于工厂化生产的特点。因而发展迅速。
4．植物组织培养技术在农业生产上的应用主要体现在：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；植物育种；工厂化育苗等。
第一章 培养条件与设计要求
教学目的与要求
掌握满足植物组织培养前提条件的方法；能够说出植物组织培养中所需要的环境条件，了解实验室的设计要求
教学重点与难点
无菌操作；培养的环境条件
第一节 无菌条件
在植物组织培养的概念中我们提到必须在“在无菌的条件下”，无菌是进行植物组织培养的前提条件，它贯穿植物组织培养的始终。而自然界中又常常伴随着大量的杂菌，因此，灭菌和无菌操作成为组织培养的常规工作之一。在此我们要了解一些灭菌的方法以及如何针对不同的灭菌对象选择相应的方法，做到在植物组织培养过程中进行无菌操作，提高成功率，减少浪费。
一、基本概念
1、有菌与无菌的范畴
有菌的范畴是指凡是暴露在空气中和接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的；而无菌的范畴是指经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，或经其他理化灭菌方法（并证明是有效的）处理后的物体，高层大气、岩石内部，健康动植物体内不与外界接触的组织内部、强酸强碱、灭菌剂表面及内部等都是无菌的。由此可见，地球表面无菌空间比有菌空间小得多。这里所说的菌是指细菌、真菌、放线菌、藻类等微生物。
2、灭菌与消毒
所谓灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有有生命的物质全部杀死；而消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。由此可见，灭菌与消毒的主要区别在于前者杀菌强烈，能杀死所有活细胞；后者作用缓和，主要杀死或抑制附在植物材料表面的微生物，但芽胞、厚垣孢子一般不会死亡。但是，灭菌与消毒是相对的，如果消毒时间过长或消毒剂浓度过高，也可杀死全部活的细胞，消毒就成为灭菌了。反之，灭菌剂只能起到消毒作用。
二、灭菌方法
(一)物理灭菌
1、高压湿热灭菌
主要用于培养基、接种工具、无菌水等的灭菌，培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
高压湿热灭菌的原理：在高温高压的条件下，维持一定的时间,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。一般是压力为0.11 -0.15MP，温度为121-123℃，维持15-20分钟可以达到有效灭菌的目的。
影响湿热灭菌效果的因素有以下几方面：
①灭菌器内冷空气排出的程度
②灭菌物品的数量、包装和放置
③加热速度
④ 超高热蒸汽
2、干热灭菌
灼烧灭菌主要用于无菌接种的器械。无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀浸入95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后立即使用。
干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。通常采用170℃持续90min来灭菌。
3、过滤灭菌
过滤灭菌主要用于不耐热的物质如赤霉素、玉米素和某些维生素的灭菌。其过滤原理是通过直径为0.45μm以下的微孔滤膜使溶液中的细菌和真菌的孢子等因大于滤膜直径而无法通过滤膜，从而达到灭菌的效果。
4、紫外线灭菌
主要用于接种室、缓冲间、超净工作台或接种箱的空间灭菌。
原理：利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，导致死亡。
但是由于紫外线的穿透力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。
(二)化学灭菌
化学灭菌是指利用化学物质杀灭、抑制微生物的方法。这种物质称为灭菌剂(有时也称为消毒剂)。按其作用水平，可分为灭菌剂(即高效消毒剂)、中效消毒剂、低效消毒剂、防腐剂和保藏剂。
` 1、熏蒸灭菌
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8m1／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g／m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
2、喷雾灭菌
一些物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70％的酒精反复涂擦灭菌，1％-2％的来苏儿溶液以及0.25％-1％的新洁尔灭也可以。
3、植物材料表面用消毒剂灭菌
三、无菌操作
外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织或细胞转入到无菌培养基上的过程。由于整个过程都是在无菌条件下进行的，所以又称为无菌操作。
第二节 培养条件
一、温度(temperature)
大多数植物组织培养 都是在23-27、之间进行，一般采用25土2℃。低于15℃时培养，植物组织会表现生长停止，高于35、时对植物生长不利。
二、光照(1ight)
1．光照强度(1ight intensity)
2．光质(light wave)
3．光周期(1igh period)
三、湿度(humidity)
一般要求70％-80％的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。
四、渗透压(penetrating pressure)
通常1-2个大气压对植物生长有促进作用。
五、pH值
不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要
六、气体(gas)
第三节 实验室与育苗工厂的硬件要求
一、设计原则与总体要求
(一)设计原则
1、防止污染。控制住污染，就等于组织培养成功了一半。
2、按照工艺流程科学设计，结构和布局合理，节能、安全,便于操作，利于提高生产效率。
3、根据培养目的和规模来设计。其规模大小根据市场需求、年预期产苗量、投资额、现有条件等因素综合确定，体现适用性。
4、对于家庭组培室要因地制宜，简化程序，因陋就简。
(二)总体要求
1、选址要求避开污染源。
2、室内装修做到六面光亮
3、各分室的大小、比例要合理。
4、接种室、培养室从严要求
5、充分利用自然温光资源
二、实验室的基本组成
一个标准的组织培养实验室应当包括洗涤室、配制室、灭菌室、缓冲间、接种室、培养室、观察室、驯化棚室等。在设计时结合具体情况，可以合并部分分室。
（一）洗涤室
1、主要功能 用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等。
2、设计要求 根据工作量的大小决定其大小，一般10m2左右。要求房间宽敞明亮，方便多人同时工作；有电源、自来水和水槽（池），上下水道畅通；地面耐湿、防滑、排水良好，便于清洁。
3、仪器与用具配置 工作台、烘箱、晾干架、周转筐（塑料或铁制）、各种规格的毛刷、药品柜等。
（二）培养基配制室
1、主要功能 培养基的配制、植物材料的预处理。
2、设计要求 要求房间宽敞明亮、通风、干燥、清洁卫生，便于多人同时操作；有电源、自来水和水槽（池），保证上下水道畅通。
3、仪器与用具配置
（三）灭菌室
1、主要功能 用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。
2、设计要求 要求安全、通风、明亮；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽（池）、电源或煤气加热装置和供排水设施；保证上下水道畅通，通风措施良好。
3、仪器与用具配置 压力灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置、工作台、培养基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。
（四）缓冲间
1、主要功能 防止带菌空气直接进入接种室和工作人员进出接种室时带进杂菌。接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。
2、设计要求 要求空间洁净，墙壁光滑平整，地面平坦无缝，并在缓冲间和接种室之间用玻璃隔离，配置平滑门，以便于观察、参观和减少开关门时的空气扰动。
3、仪器与用具配置 紫外光灯、小洗手池、搁架、鞋架、衣帽钩、拖鞋、工作服、实验帽和口罩等。
（五）接种室
1、主要功能 进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培养的成功与否起着重要作用。
2、设计要求 要求密闭、干爽安静、清洁明亮；塑钢板或防菌漆的天花板、塑钢板或白瓷砖的墙面光滑平整，不易积染灰尘；水磨石或水泥地面平坦无缝，便于清洗和灭菌。
3、仪器与用具配置 超净工作台、空调机等
（六）培养室
1、主要功能 培养离体材料。
2、设计要求
3、仪器与用具配置
(七)观察室
（八）驯化棚室
1、主要功能 进行组培苗的驯化移栽。
2、设计要求 组培苗的驯化移栽通常在温室或塑料大棚内进行。
3、仪器与用具配置
参观学校的组培室
三、组培育苗工厂的基本组成
育苗工厂应包括组培苗生产车间和驯化栽培区。其中组培苗生产车间主要包括洗涤车间、培养基配制车间、灭菌车间、接种车间、培养车间；驯化栽培区包括移栽驯化车间和育苗苗圃，可以单独设置。此外，还有办公室、值班室、仓库、会议(培训)室、冷藏室、产品展示厅等附属用房。
四、家庭组培室的基本组成
根据组培苗生产的基本需要及房间的数量、面积大小，合理确定家庭组培室的基本组成。如果房间较多、面积较大，家庭组培室设计准备室、接种室和培养室；如果房间较少，接种室可与培养室合而为一，也可以用简易接种箱代替接种室，准备室可与厨房或餐厅通用。也可以将面积较大的房间间隔为上述具有不同功能的空间。
本章小结
温度、光照、氧气、PH、湿度都会影响到组织培养成功率，因此，实际培养外植体时，要根据不同的植物材料，将上述因素调整到适宜的范围。
第二章 培养基
教学目的与要求
一般掌握培养基的种类、特点和各自的作用
教学重点与难点
培养基的成分与作用；主要培养基的特点；母液的配制与培养基的制作
第一节 培养基的成份与种类
培养基是提供植物生长发育所需各种养分的介质。在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。因此，理解培养基的组成及其作用，掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。
一、培养基的成份
(一)水分
(二)无机盐
1.大量元素
大量元素是指植物生长发育所需的浓度大于0.5 mmol/L的营养元素，主要有N、P、K、Ca、Mg、S等。
2.微量元素
微量元素是指植物生长发育所需的浓度小于0.5 mmol/L的营养元素，主要有Fe、Mn、Cu、Mo、Zn、Co、B等。
(三)有机化合物
1.糖类
糖类提供外植体生长发育所需的碳源、能量，使培养基维持一定的渗透压。蔗糖是最常用的糖类，可支持许多植物材料良好生长。其使用浓度一般为2%～5％，常用3％，但在胚培养时可高达15％，因蔗糖对胚状体的发育起着重要作用。在大规模生产时，可用食用白糖代替，以降低生产成本。
2.维生素类
完整植株在生长过程中能自身合成各种维生素，可满足自身各种代谢活动的需要。但在离体培养中则不能合成足够的维生素，需要另加一至数种维生素，才能维持正常生长。常用的维生素有VB1、VB6、VPP、VC等。
3.肌醇
4.氨基酸
氨基酸是良好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用，在培养基中含有无机氮的情况下，更能发挥其作用。
5.天然有机复合物
常用的天然有机复合物有椰乳、香蕉泥、马铃薯提取物、酵母提取液、苹果汁、番茄汁等。
(四)植物激素
植物激素是培养基的关键性物质，对植物组织培养起着决定性的作用。
1.生长素类
①种类与活性强弱 常用的有IAA、IBA、NAA、2，4-D，其活性强弱为2，4-D>NAA>IBA>IAA，一般它们的活性比为：IAA∶NAA∶2，4-D = 1∶10∶100。
②作用
诱导愈伤组织形成; 促进根的生长; 协助细胞分裂素促进细胞分裂和伸长。
③稳定性和溶解性 除了IAA不耐热和光，易受到植物体内酶的分解外，其他生长素激素对热和光均稳定。
生长素类溶于酒精、丙酮等有机溶剂。在配制母液时多用95%酒精或稀NaOH溶液助溶。一般配成0.1mg/ml～0.5mg/ml的母液贮于冰箱中备用。
2.赤霉素(GA)
①作用
主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质化，比值低时有利于韧皮化。另外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。
②稳定性和溶解性 赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95%酒精助溶。它与IAA一样不耐热，需在低温条件下保存，使用时采用过滤灭菌法加入。如果高温高压灭菌赤霉素将有70～100%失效。
3.细胞分裂素类
①种类及活性强弱 这类激素是腺嘌呤的衍生物，常见的有6-BA、KT、ZT、2-ip等。其活性强弱为2-ip > ZT > 6-BA > KT。
②作用
抑制顶端优势，促进侧芽的生长；诱导愈伤组织或器官分化出不定芽；促进细胞分裂与扩大，延缓衰老；抑制根的分化。
③稳定性与溶解性
细胞分裂素能溶解于稀酸和稀碱中，在配制时常用稀HCl助溶。
(五)培养物的支持材料
1.琼脂
琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供给培养物任何营养。它是固体培养时最好的固化剂。
2.其它
(六)活性炭
加入活性炭的目的主要是利用其吸附性，减少一些有害物质的不利影响，如能够吸附一些酚类物质，可减轻组织的褐化（在兰花组培中作用效果明显）。此外，创造暗环境，有利于某些植物的生根。
(七)抗生素
抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等。
三、培养基的种类与特点
（一）培养基的种类
虽然培养基的种类名称很多，但只要抓住划分的依据就容易理解和记忆。
1、根据态相不同，培养基可分为固体培养基与液体培养基。
2、根据培养阶段不同，可分为初代培养基、继代培养基。
3、根据培养进程和培养基的作用不同，培养基分为诱导(启动)培养基、增殖(扩繁)培养基及壮苗生根培养基。
4、根据其营养水平不同，分为基本培养基和完全培养基。
基本培养基即平常所说的培养基，如MS、White培养基。
完全培养基由基本培养基和添加适宜的激素和有机附加物组成。
对培养基的某些成分进行改良而成的培养基称为改良培养基。
(二)常用培养基的特点
第二节 培养基的制作
一、母液的配制
在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。
下面以MS培养基制备为例，概述其制备方法。
(1)大量元素母液可配成浓度10倍母液。用分析天平按配方称取药品，分别加100ml左右蒸馏水溶解后，再用磁力搅拌器搅拌，促进溶解。注意Ca2+和阳Po43-易发生沉淀。然后倒人1000ml定容瓶中，再加水定容至刻度，成为10倍母液。
(2)微量元素母液 可配成浓度配成比100倍的母液。用分析天平按表准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000ml。
(3)铁盐母液 可配成100倍的母液，按表称取药品，可加热溶解，混合后加水定容至1000ml。
(4)有机物母液 可配成500倍的母液。按表分别称取药品，溶解，混合后加水定容至500ml。
(5)激素母液的配制
每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成1mg／ml。用时根据需要取用。因为激素用量较少，一次可配成50ml或100ml。另外，多数激素难溶于水，要先溶于可溶物质，然后才能加水定容。
它们的的配法如下：
将IAA、IBA、GA等先溶于少量的95％的酒精中。再加水定容-定浓度。NAA可先溶于热水或少量95％的酒精中，再加水定容到一定浓度。2，4-D可用少量1mol NaOH溶解后，再加水定容到一定浓度。将Kt和BA先溶于少量1mol的HCI中再加水定容。将玉米素先溶于少量95％的酒精中，再加热水到一定浓度。配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。
二、培养基的配制（融入实验）
三、培养基的分装与灭菌（融入实验）
第三节 培养基的筛选
一、试验前的准备工作
1.文献检索
查找文献的途径主要有：
①专业杂志或有关杂志上查阅；
②互联网上查找
③报纸或电视等媒体上获取。
2.参观咨询
二、预备试验
所谓预备试验就是指正式试验开始之前根据试验设计进行的过渡试验，为正式试验的开展所做的前期摸索。
三、常用的试验方法
1.单因子试验
单因子试验是指整个试验中保证其他因素不变，只比较一个试验因素的不同水平的试验。
2.双因子试验
双因子试验是指在整个试验中其他因素不变，只比较两个试验因素的不同水平的试验。
3.多因子试验
4.逐步添加和逐步排除的试验方法
本章小结
1．培养基多以命名人的名字命名。目前，比较流行的培养基有：MS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高；B5培养基，其特点是含有较低的铵；White培养基，其特点是无机盐低，适于生根；N6培养基，其特点是KNO3和（NH4）2SO4含量较高，适于花药培养；KM－8P培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。
2．水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分。这五种成分有各自的作用效果和要求。
3．配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液。即先配成大量元素10倍液，定容至1000ml；微量元素100倍液，定容至1000ml；铁盐100倍液，定容至1000ml；维生素1mg∕l，定容至100ml；激素1mg∕l，定容至50～100ml。
4．培养基分装到100ml的三角瓶，用量一般为每瓶30～40ml，过多造成浪费，过少则不利于植物的生长；高压灭菌时，压力通常为0。10Mpa，20分钟。
5．筛选合适的培养基一般有四种方法，即单因子试验法、多因子试验法、逐步添加和排除法以及广谱实验法。其中，第一种方法比较简单，第二种方法比较准确，而后两种方法则比较复杂。
第三章 植物组织培养一般程序
教学目的与要求：
掌握植物组织培养的一般程序；掌握外植体选择的原则与处理方法；掌握增殖培养和生根的方法；掌握植物组织培养过程的问题及解决
办法
鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载企业年金办法下载企业年金办法下载
。
教学重点与难点：
植株再生的途径；增殖与生根的方法；三大难题的解决措施
植物组织培养的完整过程一般分为制定培养方案、外植体选择与处理、接种、初代培养、继代培养、壮苗与生根培养、试管苗的驯化移栽等几个技术环节。
第一节 启动培养
初代培养是指在组培过程中，最初建立的外植体无菌培养阶段，即无菌接种完成后，外植体在适宜的光、温、气等条件下被诱导成无菌短枝(或称茎梢)、不定芽(丛生芽)、胚状体或原球茎的过程。因此，也称为诱导培养。由于外植体的来源复杂，又携带较多杂菌，因此初代培养一般比较困难。
一、外植体的选择与处理
植物组织培养的成败除与培养基、培养条件的正确选择有关外，另一个重要因素就是外植体本身，即由活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。外植体选择是否适宜，以及对其处理的方法是否得当，直接关系到组织培养的难易程度和培养方向。因此，掌握外植体的选择原则及其处理方法是十分重要的。
（一）外植体的选择原则
1.植物基因型
一般来说，草本植物易于木本植物；双子叶植物易于单子叶植物。
2.生理状态
越幼嫩、年限越短的组织越具有较高的形态发生能力，组织培养越易成功。
3.取材季节
外植体最好在其生长开始的季节选取
4.植物的长势
生长健壮的器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养容易成功。
5.取材部位
在确定取材部位时，一方面要考虑培养材料的来源是否有保证和容易成苗；另一方面要考虑经过脱分化产生的愈伤组织的培养途径是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。
6.外植体大小
选择外植体的大小，应根据培养目的而定。如果是胚胎培养或脱除病毒，则外植体宜小；如果是进行快速繁殖，外植体宜大。但外植体过大，消毒往往不彻底，易造成污染；过小则离体培养难于成活。一般外植体大小在0.5～1.0 cm为宜。具体说叶片、花瓣等约为5mm×5 mm，茎段长约带1～2个节，茎尖分生组织带1～2个叶原基，大小约0.2～0.5 mm等。
（二）外植体的处理
1、外植体处理的基本过程
从田间取回的离体材料，往往带有较多的泥土、杂菌，不宜直接接种，需要对材料进行预处理和必要的修整。
2、材料消毒原则
材料接种前必须进行表面消毒。由于植物种类、取材部位、母体植株的生态环境、取材季节和天气状况的不同，所采集的材料带菌程度也不同，而且材料对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。所以，选择哪种消毒剂、浓度大小和消毒时间的长短一定要有针对性，这样才有可能达到预期的消毒效果。为此，需要掌握的消毒原则是既要杀死离体材料表面的全部微生物，又不损伤或只轻微损伤植物材料。
3、常用的消毒剂
作为好的消毒剂既要有良好的消毒作用，又要容易被无菌水冲洗掉或能自行分解。此外，还不会损伤材料，影响细胞的生长。
二、植株再生途径
植株再生途径一般可划分为无菌短枝型、器官发生型、丛生芽增殖型、胚状体、原球茎发生型五种类型，所形成的植株称为再生植株。
1、无菌短枝型
2、丛生芽增殖型
3、器官发生型
影响器官发生的主要因素有外植体、培养基和培养环境等。
①外植体
②培养基
③培养环境
4、胚状体发生型
5、原球茎发生型
第二节 继代与生根培养
一、继代培养
在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。
继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。
继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。
二、生根培养
当丛生芽苗增殖到一定数量后要分离成单苗转入生根培养基进行生根诱导。一般认为矿质元素含量高，有利于茎叶生长，较低时有利于生根。所以生根培养基多采用1/2 MS或者1/4 MS培养基。另外，培养基要去掉全部细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。因植物种类不同，一般2～4d 即可见根原基发生，当洁白的生长正常的根长约1cm时即可驯化移栽。
1、诱导生根方法
①将新梢基部浸入50 ppm或100 ppm IBA溶液中处理4～8 h；
②在含有生长素的培养基中培养4～6 d；
③直接移入含有生长素的生根培养基中。
上述三种方法均能诱导新梢生根，但前二种方法对新生根的生长发育更为有利，而第三种对幼根的生长有抑制作用。
另外也可采用下列方法生根：
①延长在增殖培养基中的培养时间；
②适当降低增殖倍率，减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步)；
③切割粗壮的嫩枝用生长素溶液浸醮处理后在营养钵中直接生根。
第三节 试管苗的驯化移栽
试管苗驯化移栽是植物组织培养的重要环节，这个环节做不好，就会前功尽弃。生产实践中应根据试管苗与自然苗、试管苗的生存环境(以下简称“生境”)与自然环境的差异，人为创设从试管苗生境逐渐向室外环境转化的过渡条件，以确保试管苗的移栽成活率。
一、试管苗的特点
(一)试管苗与实生苗生境的差异
(二)试管苗与实生苗在形态结构及功能上的差异
二、试管苗的驯化
(一)驯化的目的
驯化的目的是人为创设一种由试管苗生境逐渐向自然环境过渡的条件，促进试管苗在形态、结构、生理方面向正常苗转化，使之更能适应外界环境，从而提高试管苗移栽的成活率。
(二)驯化的原则
根据试管苗的特点及其生境与田间环境差异，驯化原则应从光、温、气、湿及有无杂菌等环境要素考虑。前期以创设与试管苗原来生境相似的条件，后期则创设与自然环境相似的条件，以利试管苗在形态结构及生理功能方面顺利发生向适应外界环境的转化，从而有效提高移栽成活率。
三、试管苗的移栽
(一)移栽时期
移栽时期最好选择该种植物的自然出苗季节。
(二)移栽设施
栽培容器可用6 cm×6 cm－10×l0cm的软塑料钵，也可用育苗盘。
(三)移栽基质
适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和保肥的特点。
四、提高试管苗驯化移栽成活率的措施
(一)试管苗驯化移栽成活率低的原因
1、内因
主要有植物种类与试管苗的质量。
2、外因
主要有环境条件、管理措施及管理人员的责任心。
(二)提高试管苗驯化移栽成活率的措施
1、培育壮苗，及时出苗
2、改善试管苗的驯化环境
3、选择恰当的种植基质
4、加强温湿度管理
第四节 组培的常见问题及预防措施
在植物组织培养中，一直困扰工作人员的是污染、褐化和玻璃化这三大难题。
一、污染
1.污染的含义
污染是组织培养最常见和首要解决的问题。所谓污染是指在组织培养过程中，由于细菌、真菌等微生物的侵染，在培养基的表面滋生大量菌斑，造成培养材料不能生长和发育的现象。
2.污染的类型与症状
引起污染的微生物主要有芽胞杆菌、大肠杆菌等细菌和毛霉、根霉、青霉等真菌，与此相对应的污染类型就分为细菌性污染和真菌性污染。细菌性污染的症状是菌落呈黏液状，颜色多为白色，与培养基表面界限清楚，一般接种后1～2d就能发现；而真菌性污染的症状是菌落多为黑色、绿色、白色的绒毛状、棉絮状，与培养基和培养物的界限不清，一般接种后3～10d后才能发现。实际培养中要明确辨认出是哪种污染，以便有针对性地采取防治措施，从而提高组培成功率。
3.污染的途径
①外植体灭菌不彻底；②操作时人为带入；③环境不清洁；④培养基及接种工具灭菌不彻底。
4.污染的防治措施
（1）防止外植体带菌
(2)培养基和接种器具彻底灭菌
（3）严守无菌操作规程，防止操作时带入 这里要强调以下几点：
（4）保持环境清洁
二、褐化
1.褐化的含义
褐化又称为褐变，是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐甚至死亡的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。培养材料褐化所产生的醌类物质当扩散到培养基后，会抑制其他酶的活性，导致代谢紊乱，从而影响离体材料的培养。
2.褐化的影响因素
(1)植物种类和品种
(2)生理状态
(3)培养基成分
(4)培养条件不当
(5)材料转移时间
(6)外植体大小
(7)外植体受损程度
3.褐化的预防措施
(1)尽量冬春季节采集幼嫩的外植体，并加大接种量；外植体和培养材料最好进行20～40d的遮光处理或暗培养。
(2)选择适宜的培养基，调整激素用量。
(3)选择合适的培养条件 在不影响外植体正常生长和分化的前提下，尽量降低温度，减少光照。
(4)使用抗氧化剂
(5)加快继代转瓶速度
(6)合理使用消毒剂
三、玻璃化
1.玻璃化的含义
当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化(也称为超水化现象)。发生玻璃化的试管苗称为玻璃化苗。
2.玻璃化苗的症状表现
试管苗矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气孔，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明；叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易碎；组织发育不全或畸形；体内含水量高，干物质等含量低；试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成活率极低，因而繁殖系数低。
3.试管苗玻璃化的原因
(1)细胞分裂素浓度过高，易导致玻璃化苗的发生
(2)培养基成分
(3)琼脂用量
(4)温度和光照
(5)通风条件
(6)植物材料
4.防止玻璃化苗发生的措施
(1)适当提高培养基中蔗糖和琼脂的含量水平，降低培养基的水势。
(2)选择合适的激素种类和浓度，适当减少细胞分裂素用量或适当增加生长素比例。
(3)适当延长光照时间或增加自然光照，提高光强。
(4)调整培养温度，培养室要有降温和增温设施，防止温度突然变化。
(5)使用透气性好的封口材料。如牛皮纸、棉塞、滤纸、封口纸等，尽可能降低培养内空气湿度，加强气体交换。
(6)尽量选用玻璃化轻或无玻璃化的植物材料。
(7)适当提高培养基中的无机盐的含量，减少铵态氮而提高硝态氮的用量。
(8)在培养基中适当添加活性炭、间苯三酚、根皮苷、聚乙烯醇(PVA)均可有效控制玻璃化苗的发生。
四、其他问题
组织培养过程中除了污染、褐化和玻璃化三大技术难题之外，还有黄化、变异、瘦弱或徒长等问题。
本章小结
接种后材料的培养步骤可分为：（1）初代培养，（2）继代培养，（3）生根培养。驯化时要注意培养基质的选择和温、光、水、肥、气的综合管理。
第四章 植物的器官培养
教学目的与要求
1．一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择
2．掌握茎尖培养的种类和操作步骤
教学重点与难点
植物营养器官的培养
第一节 营养器官培养
营养器官培养器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。以器官作为外植体进行离体培养，是植物组织培养中最主要的一个方面，进行的植物种类最多，应用的范围也最广。
一、 离体根培养
离体根培养是进行根系生理和代谢研究的最优良的实验体系，因为根系生长快，代谢强，变异小，加上无菌，不受微生物干扰，能根据研究需要，改变培养的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化。另一方面，由根细胞可再生成植株，不仅证明根细胞的全能性，也产生了无性繁殖系，用于生产实践。培养方法如下：
1．培养基 White或MS、B5浓度稀释到2/3或1/2。
2．根无性繁殖系的建立 培养条件为暗光25～27℃。
3．植株再生培养 诱导形成愈伤组织→再分化培养基上诱导芽的分化、在愈伤组织上分化成小植株
二、 茎尖培养
茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。这是组织培养中用得最多的一个取材部位。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。微茎尖指带有1～2个叶原基的生长锥，其长度不超过0.5mm。普通茎尖指较大的茎尖（如几mm到几十mm）、芽尖及侧芽。这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短。茎尖培养步骤如下：
1．取材
2．消毒
3．接种
4．培养的方法和程序
（1）培养基：多数茎尖培养采用MS作为基本培养基或略加修改，或补加其它物质。常用的其它培养基有White，Heller等，培养基中生长素是必须的。
茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快和生长正常等三种类型：
生长太慢，即接种后茎尖不增大，只是茎尖逐渐变绿，出现绿色小点，细胞逐渐老化而进入休眠状态，或者逐渐变褐死亡。引起原因的是生长素浓度太低，或是温度过低或过高；
生长太快型，是接种后茎尖迅速增大，在茎尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎尖不伸长，久之茎尖也形成愈伤组织，从而丧失发育成苗的能力。引起原因一是生长素浓度过高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。二是光照太弱或温度太高。
生长正常型，是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并逐渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。
（2）培养条件 接种到培养基上的茎尖，置于培养室中培养，每天照光16小时，照度1500～3000Lx即可，温度通常在25±2℃。
三、茎段培养
茎段培养指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。
茎段培养用于快速繁殖的优点在于：培养技术简单易行，繁殖速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖问题等。
1．材料的选择和处理
2．培养 在茎段培养中，促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的，依次为Kt和Zt等。生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长。GA对芽伸长有促进作用。
继代扩繁是茎段培养的主要一步。这可由二种途径解决：一是促进腋芽的快速生长，二是诱导形成大量不定芽。
继代增殖过程所用培养基和生长调节剂与初代培养相同。
四、离体叶培养
离体叶培养包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。
在自然界，很多植物的叶具有强大的再生能力，能从叶片产生不定芽的植物，以羊齿植物最多，双子叶植物次之，单子叶植物最少。再生成植株的方式有二种：一种是直接诱导形成芽，另一种是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化成植株，叶的离体培养技术如下：
1、材料选择及灭菌
2、接种 把灭菌过的叶组织切成约0.5cm见方小块或薄片（如叶柄和子叶），接种在MS或其它培养基上。培养基中附加BA1～3mg/L，NAA0.25～1mg/L。
3、培养 叶接种后培养条件为每天10～12小时光照，光强1500～3000Lx。培养约2周至4周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。这时应转移到再分化培养基上进行分化培养，分化培养基的细胞分裂素含量为2mg/L左右，约10天左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点，它将发育成无根苗。若再将苗移至含NAA0.5～1mg/L的生根培养基可诱导成根，从而发育形成完整的植株。
第二节 生殖器官培养
一、 花器官和种子培养
（一）花器官培养
花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。
1．取材 从健壮植株上取未开放的花蕾进行表面灭菌
2．接种培养 用整个花蕾培养时，只要把花梗插入培养基中。若用花器的某个部分，则分别取下，切成小片，放入培养基中。常用的培养基有MS、B5等。
（二）种子培养
种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。
利用种子培养可以打破种子休眠，特别对一些休眠期长的植物；可以作为大量生产试管苗的好材料，它具有植株分化容易，无菌操作方便等特点。可使远缘杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代植株。培养技术如下：
1、种子灭菌
2、培养基 成分要求较简单，可不加或少加生长激素。
二、 胚胎培养
植物胚胎培养是胚及胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。
（一）胚胎培养的意义
１．克服远缘杂种的不育性
２．使胚发育不全的植物获得后代 如兰花、天麻的种子成熟时，胚只有6～7个细胞，多数胚不能成活。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植物。
３．缩短育种年限 在杂交育种中，应用胚培养技术可以缩短育种周期1～2年。
（二）离体胚培养
１．成熟胚培养 成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。
２．幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。
三、胚珠培养
胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。胚珠培养可以解决像兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。
本章小结
1．植物器官培养是组织培养当中一个最重要的方面，应用范围最广泛。它是指植物离体的根、茎、叶、花、果和种子的无菌培养。
2．根培养不仅可以很方便地研究根的生理代谢，而且利用White培养基也能再生成幼小植株。
3．花培养是指整个花器官或花的组成部分之一的无菌培养，基本培养基一般用MS或B5。
4．种子无菌培养操作简便，植株分化容易，可以一定程度上克服育种上远缘杂交的不育性。
5．胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养和胚乳培养等。具有以下意义：（1）克服远缘杂种的不育性，（2）使胚胎发育不完全的植株获得后代，（3）缩短育种年限，提高育种效率。
第五章 原生质体培养
教学目的与要求
1、了解原生质体培养的意义；
2、掌握原生质体分离所需要的酶及其作用概述
教学重点与难点
原生质体的分离与培养
原生质体（protoplast）是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
一、原生质体培养的意义
1、再生植株
由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：
①可利用均一的分化细胞群体；
②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；
③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要 4亩地；
④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需l～2个小时。
2、用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
二、原生质体的分离
要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。
（一）植物材料
一般来说，植物各个器官，如：根、茎卅、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
1、细胞悬浮培养物
2．叶肉细胞
3．植物材料的预处理
（二）酶
1．酶的种类
构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25 ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
2．渗透稳定剂
3．酶溶液的pH值
（三）原生质体的分离
酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
（四）影响原生质体分离的因素
1．酶制剂活力和纯度
2．渗透稳定剂的作用
三、原生质体的培养
将有生活力的原生质体在适当的培养基和培养条件下培养，很快就开始出现细胞壁再生和细胞分裂的过程。约l～2个月后，通过细胞的持续分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导芽和根长成完整的植株。
（一）培养原生质体的方法
原生质体的培养方法大体和细胞培养相同，有固体培养、液体培养及固液结合培养等几种方法。
1、固体培养法
2、液体培养
3、固液结合培养法
（二）影响原生质体培养的因素
1．培养基成分
2．渗透压稳定剂
3．无机盐
4．有机成分
5．激素
尽管原生质体培养对激素的种类和浓度的要求有很大差异，但总的来说，生长素和细胞分裂素是必需的，并需要二者的适当搭配。
6．pH值
7．无机盐
8．原生质体密度的影响
四、原生质体的融合
原生质体的融合方式分自发融合和诱导融合两类。自发融合是在植物原生质体分离过程中，用酶法分解细胞壁后进行融合。这类融合是种内融合，与胞间连丝有关，融合的个体一般不能进一步发育。诱导融合是指制备出原生质体后，加入诱导剂或用其他方法促使两个亲本原生质体融合，诱导融合可以是种内的，也可以是种间的，甚至是属间、科间的融合。
诱导融合的方法大体可以分为物理的和化学的两类。前者是利用显微操作、灌流吸管、离心或振动等机械以促使原生质体融合，这种方法目前多与诱导剂结合起来使用，化学融合法是用不同的试剂作诱导剂，促使原生质体融合。目前常用的比较有效的是高pH值一高钙法和聚二乙醇法。
1．高PH一高钙法
2．聚乙二醇法
本章小结
1．原生质体培养可以再生植株，可以远缘体细胞融合，达到体细胞杂交的目的。
2．原生质体分离可按下列步骤进行：选择材料（悬浮细胞或叶肉细胞）——预处理——酶解。
3．原生体培养时，先要纯化细胞，然后接种在固体培养茎或液体培养基中。
4．原生质体融合采用高pH值一高钙法，即pH值9．5～10.5，0.03Mca处理，或用聚乙二醇法。
第六章 植物组织培养技术的应用
教学目的与要求：
1、了解目前植物组织培养在生产和科研中的主要应用
2、学习试管微嫁接技术
3、理解植物无毒苗培养的原理
4、了解低温保存和超低温保存技术
教学重点与难点：
微嫁接技术；热处理和茎尖脱毒的原理；低温保存和超低温保存技术的方法
第一节 快速繁殖（微繁殖）
参考第三章 植物组织培养的一般程序和第四章植物的器官培养
第二节 微嫁接
一、概念
微嫁接(micro-grafting)是一种在试管内将砧木与接穗进行嫁接的技术，它是植物组织培养与嫁接技术的结合。
二、微嫁接的种类
根据所选接穗不同，可分为：茎尖嫁接、微枝嫁接、愈伤组织嫁接和细胞嫁接等。
茎尖嫁接 是指在无菌条件下将生长枝的茎尖嫁接在去顶的试管苗或茎段上，在适宜的条件下培养成为新植株。
微枝嫁接 是指在无菌条件下将试管苗的茎段嫁接到另一株去顶的试管苗或茎段上，在适宜条件下培养成为新植株。
愈伤组织嫁接 是指将不同植物的愈伤组织进行混合培养，以获得嫁接嵌合体的方法，它可避免整体嫁接时由切割造成的隔离层对接穗与砧木细胞真正关系的掩盖作用。
细胞嫁接 是指将不同植物的细胞或原生质体进行混合并继代培养，诱导根、茎、叶的分化，形成植株。
二、特点
与常规的嫁接方法相比，微嫁接具有其自身特有的优越性:
(1)周期短、费用低、占地少、成活率高；
(2)进行微嫁接后，生长条件可以人为控制，提高了有关科学研究的可信度；
(3)不受季节的限制和环境的影响，可以在实验室常年进行；
(4)有利于进行嫁接亲和力的研究。
三、微嫁接的程序
1、砧木与接穗的准备
砧木：种子萌发成的幼苗，或是直接选用试管苗。
接穗：直接取试管苗的枝芽，或是采田间或温室中旺盛生长的幼嫩枝条。
2、嫁接方法 整个过程在无菌条件下进行。
（1）腹接
将微接穗用解剖刀削成楔形，并去掉切口表面上的表皮，削好后放在铺有无菌湿润吸水纸的培养皿中保存。在砧木上斜切一个长约0.5cm的切口，将接穗插入切口并用无菌铝箔固定，然后插入培养基中培养。
（2）劈接
在去头的砧木上纵切一个长约1cm的切口，将接穗用解剖刀削成楔形，削面长约1cm，将接穗插入砧木的切口中，将嫁接口固定，并插入培养基中培养。
（3）倒“T”形点接
在去头的砧木顶端切一个倒“T”形切口，将只含顶端分生组织和2-3个叶原基的微茎尖(0.2-0.4mm)插入倒“T”形的切口中，使微茎尖的底部切口与砧木的水平切口上的皮层或形成层相接触。接好的植株转入盛有嫁接培养基的试管中，管内放置中央有孔的滤纸桥，接苗根部穿过小孔，以固定嫁接苗。
（4）微嫁接器嫁接法
四、影响微嫁接成活的主要因素
1、蔗糖浓度
2、植物生长调节剂和抗氧化剂
3、砧木
浙公网安备 33021202002483