饱和突变定向进化细胞色素P450 BM-3

饱和突变定向进化细胞色素P450BM一3 李红梅1’2，梅乐和1’2，URLACHERVB3，SCHMIDRD3 (1．浙江大学化学工程与生物工程系，浙江杭州310027；2．浙江大学宁波理工学院，浙江宁波315100； 3．InstituteofTechnicalBiochemistry，UniversityofStuttgart，Stuttgart70569，Germany) 摘 要：为了进一步获得具有更高活力的细胞色素P450BM一3(F87V／A74G／L188Q)突变酶，利用饱和突变技术 对该突变酶的4个氨基酸位点D168、A225、K434、E435分别迸行单一的随机突变，通过对其羟基化吲哚生成靛蓝 的催化性能表征，发现P450BM一3氨基酸残基的168、434和435位均位于蛋白功能区域，而225位则位于非功能 区域，同时发现突变酶D168H具有更高的结合辅酶NADPH的能力，其消耗NADPH的能力几乎是亲本酶的8 倍，但生成靛蓝的能力却只是亲本酶的3倍，说明该位点极有可能承担了将电子从黄素单核苷酸(FMN)氧化还原 酶区域传递到亚铁血红素区域的任务，在P450BM一3结构与功能的关系中扮演着重要的角色． 关键词：细胞色素P450BM一3；饱和突变；羟基化吲哚；靛蓝 中图分类号：TQ962．2 文献标识码：A 文章编号：1008—973X(2007)07—1214—05 DirectedevolutionofcytochromeP450BM一3bysaturationmutagenesis LIHong—meil”，MEILe—hel一，URLACHERVB3，SCHMIDRD3 (1．DepartmentofChemicalandBiochemicalEngineering，ZhejiangUniversity，Hangzhou310027，China： 2．NingboInstituteofTechnology，ZhejiangUniversity，Ningbo315100，China； 3．InstituteofTechnicalBiochemistry，UniversityofStuttgart，Stuttgart70569，Germany) Abstract：MutantlibrariescreatedbysaturationmutagenesisofeachsingleaminoacidsiteD168，A225， K434andE435werescreenedtofurtherimprovethecapabilityofcytochromeP450BM一3(A74G／F87V／ L188Q)mutantfromBacillusMegateriumwhichcanhydroxylateindoleintoindigo．Resultsshowedthat D168，K434andE435arelocatedatthefunctionaldomainofP450BM一3proteinwhileA225issitedatthe unfunctionaldomain．TheNADPHturnoverrateofthemutantD168Hisalmosteighttimesthatofthepa— rentalmutantP450BM一3(F87V／A74G／L188Q)，butindigoformationrateiSonlyaboutthreetimesthat oftheparentalmutant．Exchangeatposition168asparticacidreplacedbyhisitidinecouldinfluencethein— teractionbetweenthemonooxygenasedomainandtheFMN—bindingreductasedomain，whichplaysakey roleintherelationshipbetweenthestructureandfunctionofP450BM一3． Keywords：cytochromeP450BM一3；saturationmutagenesis；indolehydroxylation；indigo P450酶系是一类广泛分布于动物、植物和微生 物等不同生物体内的代谢酶系．通过X射线和多维 核磁共振等技术已经获得了8个P450酶的晶体结 构，其中2个P450酶与天然底物结合的晶体结构也 已被确认Ⅲ，包括来自于巨大芽孢杆菌(B．megate— rium)的P450BM一3，使其成为定向进化技术所热衷 的模型蛋白．天然P450BM一3具有良好的脂肪酸羟 基化活性，能快速催化链长大约为C。。～C。。的饱和 脂肪酸，但对非天然底物的催化效率较低．目前国外 有许多研究机构利用该酶作为定向进化的模型蛋白 收稿日期：2006—01—11． 浙江大学学报(工学版)网址：www．journals．zju．edu．en／eng 基金项目：国家自然科学基金资助项目(30570411)；CSC-DAAD中德合作PPP资助项目． 作者简介：李红梅(1975一)，女，四川眉州人，博士生，主要从事酶的生物催化与转化和蛋白质工程的研究 通讯联系人：梅乐和，男，教授．E—mail：meilh@zju．edu．cn 万方数据 第7期 李红梅，等：饱和突变定向进化细胞色素P450BM一3 得到了一些突变酶．这些突变酶在生物合成、外源物 质降解和环氧化物对映体合成中表现出极好的产物 和底物立体选择性，在药物和其他化学品生物合成 过程中有着重要的应用价值瞳]．李红梅等人口3通过 易错PCR(error-pronePCR)定向进化技术得到了 该酶一些突变位点的信息，改变这些突变位点能够 提高P450BM一3羟基化非天然底物吲哚的能力．本 文进一步利用饱和突变定向进化技术来研究某些位 点在改变酶催化活性方面的作用以及何种氨基酸替 换能够更有效地提高酶的催化性能，以便对P450 BM一3突变酶进行进一步的改造和优化． 1 实验部分 1．1 材料 乡^DNA聚合酶、质粒快速提取试剂盒购自Sig— Im公司(Deisenhofen，Germany)；菌种Ecoli：BL21 (DE3)、质粒pET28a(+)购自Novagen公司(Wis— consin，USA)；吲哚、靛蓝购自Fluka公司，色谱级． 1．2 P450BM-3突变体库 根据易错PCR定向进化的结果[3]，选定D168、 A225、K434、E43．5作为突变位点，引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 如表1 所示．利用Stratagene公司的QuikChangeKit[4]， 通过优化每对引物的退火温度，对 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 质粒 pET28a(+)P450BM-3进行PCR扩增，得到的扩 增产物用DpnI消化2h，原来的模版质粒是经dam 甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，只有完整的 质粒克隆才能转化到E．coliBL21(DE3)．将转化液 均匀涂布于含有30ttg／mL卡那霉素的LB(Luria一 表1饱和突变引物的设计 Tab．]Primersusedinsaturation 突变位点 引物 Bertani)琼脂平板上，在37℃过夜培养可得到相应 的突变体库． 1．3突变体库的筛选 从突变体库中挑选蓝色的活性克隆接种到200 肚L含有30／-g／mL卡那霉素的LB液体培养基的 96微孑L板中，在37℃过夜培养；取40肛L该过夜培 养液加入到一个新的600肛L含有30tzg／mL卡那霉 素的LB液体培养基的容积为1．2mL的96微孔板 中，在37℃培养至吸光度OD。。。为0．5～0．7，加入 异丙基一G—D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度0．5 mmol／L)诱导并在30℃继续培养24h；在4000r／ rain下离心0．5h，收获细胞，用300肚LpH为7．5 的磷酸盐裂解缓冲液(含0．1mg／mL的溶解酶和1 tig／mL的DNAseI)重悬细胞，在37℃培育1h 后，立即置于一80℃冷冻1h；室温解冻，在4000 r／rain下离心30rain，吸取200肚L含有P450BM一3 的上清液到一个新的96微孔分析板中，加入2“L 100mmol／L的吲哚底物(吲哚溶解在二甲基亚矾 (DMSO)中)，在室温下培育10rain后，加20肚L2 mg／mL的NADPH，启动反应；在670nm处在线监 测吸收值的变化30rain，将吸收值高于亲本酶的突 变体挑选出来，再进行至少3次类似的筛选实验， 潜在阳性克隆在蛋白质水平上进行比较验证，并进 行DNA测序． 1．4 P450BM-3突变酶的表达和纯化 提取经DNA测序鉴定的质粒，转化到E．coli BL21中，转化子在400mL含有30t_tg／mL卡那霉 素的LB液体培养基中培养至OD。。。为0．5～0．7， 加入IPTG至浓度为0．5mmol／L，诱导12h，收集 菌体沉淀，用pH为7．5的磷酸盐裂解缓冲液重悬 细胞，超声破碎后在4℃、14000r／rain下离心30 rain，取上清液采用金属鳌合亲和层析(IMAC)纯 化，其中金属鳌合介质为Ni—NTA介质[sj． 1．5 P450BM-3突变酶的活性分析 将0．6nmol的突变酶加入到pH为8．2的 Tris—HCl缓冲液中，然后加入20“L100mmol／L 吲哚的DMSO，在室温下放置10rain，反应总体积 为1mL，最后加入0．2mg的NADPH，启动反应， 在670nm处监测其吸收值的变化30rain(摩尔消 光系数￡M一3900toolq·L·cm_1)[3]． 1．6 NADPH的消耗分析 反应体系同1．5节，在340nm处监控其吸收值 的变化5min(eM一6200tool_1·L·cm叫)． 1．7蛋白质空间构象的模拟 采用SwissPdbviewer软件对突变酶构象进行 万方数据 浙 江 大 学 学 报(工学版) 第41卷 了模拟，亲本酶的晶体结构是从NCBI(National centerforBiotechnologyInformation)蛋白质数据 库获得，其中一些主要的模拟参数：PDBID (1BVY)，分辨率为2．03×10_10m，剩余值(R—fac— tor)为0．187，自由剩余值(R—free)为0．275：6I． 2实验结果与分析讨论 2．1 饱和定点突变技术PCR扩增结果 由于在设计饱和突变引物时每对突变引物都含 有3个不确定的碱基NNN使得PCR扩增的退火 温度难以精确地确定，通过对每对引物退火温度进 行优化以便得到有效的PCR扩增产物．图l是利用 饱和突变技术在最佳退火温度下得到的PCR扩增 示意图．图中：M表示1kbDNA 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品，168、225、 434和435分别表示当退火温度为52、57、52和58 ℃时饱和突变168、225、434和435氨基酸位点的 PCR产物．从图中可以看出PCR条带非常清晰且 没有非特异性扩增和引物自身二聚体的形成，为获 得有效的突变体库提供了充足的基因片断。 图1饱和突变PCR扩增DNA电泳图 Fig．1DNAelectrophoresisofsaturationmutagenesis reactions 2．2饱和突变体库筛选结果与分析 图2是饱和突变体库构建示意图，其中蓝色菌 斑是具有活性的阳性克隆，淡黄色菌斑是没有活性 的阴性克隆． 通过96微孔板高通量筛选并进行DNA测序， 得到了如图3所示的一系列的突变酶．测定12个突 变酶催化吲哚生成靛蓝时在670nm处吸光度变化 △A的大小，结果表明在168位用不同的氨基酸替 代后，催化性能有的提高，有的降低；225位氨基酸 的突变结果显示即使在这个位点替代氨基酸与原始 氨基酸的理化性质和空间结构相差很大，也不能改 变P450BM一3催化底物吲哚的活性；435位的突变 结果显示当用苏氨酸替代时，产物的产率几乎提高 了2倍；434位氨基酸替代的结果显示当用甘氨酸 替代时，P450BM一3催化吲哚的活力大大降低了． 图2蓝色活性克隆在LB琼脂平板上培养的示意图 Fig．2BlueactivecoloniesincubatedinLBagar 0．25 O．20 、十015 司 0．10 0．05 O 导宝舞欤孛 叠基蚕塞妻 图3 不同位点P450BM‘3突变酶生成蓝色物质的比较 Fig．3InvitroformationofindigobyP450BM一3 以上的突变信息有力地证明了168、434和435 位氨基酸位于蛋白的功能区域，225位氨基酸位于 非功能区域． 2．3突变体的表达和纯化 从筛选到的阳性克隆中挑选3株催化吲哚活性 高的突变体，经过测序、转化、表达、纯化获得了这些 突变体的蛋白质．经过SDS—PAGE电泳检测(图 4)，这些突变酶与亲本P450BM一3(PT)具有相同的 相对分子质量，且蛋白质的表达量都达到了35mg／ L，纯化后经检测蛋白质的质量分数达到90％，蛋白 质的浓度达到了20“mol·L． M：marker；P：亲本酶；1：D168H； 2：D168L；3：E435T 图4突变酶SDS-PAGE电泳图 Fig．4SD$PAGEofmutants 蓥媳赛瓮《突皿∞咕_【o∞∞∞一Q}{∞母_【口厂I∞也_【Q 一山 万方数据 第7期 李红梅，等：饱和突变定向进化细胞色素P450BM一3 2．4最佳氨基酸替代突变酶活性分析 分别用辅酶NADPH的消耗和产物靛蓝的生 成来表征突变酶羟基化吲哚活性的变化，如表2所 示．从表中可以看出对于突变酶D168H来说，消耗 NADPH的速率训，非常快，几乎是亲本酶(PT)的8 倍，但生成靛蓝的速率口。仅仅是亲本酶的3倍．在 图5和6中可以很明显地看出，E435T、D168L和 D168H突变酶的反应进程曲线变化趋势不同； D168H的初始反应速率最大，在同样催化条件下该 突变酶达到平衡的时间最快，但最终产物的产量却 低于E435T和D168L．图中：A。，。为靛蓝吸光值， Am为NADPH吸光值． 表2最佳突变酶催化吲哚动力学参数 Tab．2KineticparametersofindolehydroxylationofP450 BM一3mutantsbysaturationmutagenesis 0·25 0．20 毒o．15 O．10 0．05 0 0 2 5 10 15202530 t／min 图5不同突变酶催化吲哚生成靛蓝的反应进程曲线 Fig．5TimecourseofindigoinincubationswithP450 BM一3mutants 0．8 0．7 0．6 0．5 0．4 O．3 0．2 0．1 0 0 5 1015202530354045505560 t／min 图6 不同突变酶消耗NADPH的反应进程曲线 Fig．6TimecourseofNADPHconsumpationinincuba— tionswithP450BM一3mutants 2．5 突变位点与底物结合区域的蛋白质模拟 P450BM-3底物结合区域是一个狭长的通道， 从分子的表面一直延伸到亚铁血红素中心，在这个 区域几乎全是疏水性残基，仅有的带电残基是位于 表面的精氨酸和酪氨酸，这2种氨基酸被认为是通 过氢键与P450BM一3的专一性底物长链脂肪酸(比 如十六烷酸)的羧基相结合而形成的[7]． 从模拟图7中可以看出，第168位的天冬氨酸 位于酶分子的表面，与第87位点邻近，接近于亚铁 血红素区域．早期的许多研究表明在环绕底物结合 区域即亚铁血红素区域，通过理性设计获得的 F87V[73或F87A[81突变，扩大了酶分子活性部位底 物进入通道，使酶能够催化更多新的底物，显然168 位可能同87位一样在该酶的结构和功能中扮演着 重要的角色．本文的实验结果表明当用组氨酸替代 原始的天冬氨酸时，该突变酶具有更高的结合 NADPH和催化吲哚的能力，说明该位点会影响 P450BM一3单加氧酶和FMN还原酶之间传递电子 的相互作用． P450BM-3晶体结构显示，底物结合区域的右 侧富集螺旋结构，左侧富集片层结构’9j，434位的赖 氨酸和435位的谷氨酸恰好位于酶分子底物通道左 侧区域(图7)．当用苏氨酸来替代435位的谷氨酸 时，突变酶羟基化吲哚的活力提高很大，由于苏氨酸 的侧链远远短于谷氨酸的侧链，这一突变同F87V 或F87A一样拓宽了底物通道，使得底物能够更加 迅速地通过底物通道进入催化区域．尽管当用甘氨 酸来替代434赖氨酸时，底物的通道同样变大了，但 作用却大相径庭，酶羟基化吲哚的能力大大降低了． 赖氨酸通常作为一种功能性很强的氨基酸出现在酶 分子的活性中心，本文的实验结果同样支持这一结 论．从模拟图中还可以看出第225位氨基酸大大地 远离底物结合区域． 图7 P450BM-3底物结合区域蛋白质模拟 Fig．7SubstratedomainofP450BM一3proteinmodel 3 结语 通过饱和突变定向进化技术获得了一系列突变 万方数据 1218 浙 江 大 学 学 报(工学版) 第41卷 酶，并对突变酶的催化性能进行了检测，结合已知的 晶体结构数据和蛋白质模拟技术，发现细胞色素 P450BM-3的168、434、435氨基酸位点位于该酶的 蛋白质功能区域，而225位点位于非功能区域．尽管 实验中所选用的催化底物吲哚和P450BM-3的天 然底物脂肪酸的结构大相径庭，但这些突变酶表现 出更高的羟基化吲哚的能力，有力地证明了酶的底 物专一性和催化性能是能够通过定向进化技术来改 造的．目前进一步提高P450BM一3突变酶羟基化吲 哚生成靛蓝仍然面临着挑战，但是定向进化技术为 深入改造酶的功能特性以使其更适于工业化用酶提 供了一个快捷而有效的技术平台． 参考文献(References)： [1]URLACHERVB，SCHMIDRD．Proteinengineering ofthecytochromeP450monooxygenasefromBacillus megaterium口]．MethodsinEnzymology，2004，388： 208—224． r2]URLACHERVB，LUTZ—WAHLS，SCHMIDRD． MicrobialP450enzymesinbiotechnology[J]．Applied MicrobiologyandBiotechnology，2004，64：317—325． [3]李红梅，梅乐和，URLACHERVB，等．催化吲哚生成 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URLACHER V B,SCHMID R D,URLACHER V B,SCHMID R D(Institute of Technical Biochemistry,University of Stuttgart,Stuttgart 70569,Germany) 刊名： 浙江大学学报（工学版） 英文刊名： JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY(ENGINEERING SCIENCE) 年，卷(期)： 2007,41(7) 被引用次数： 1次 参考文献(9条) 1.李红梅;梅乐和;URLACHER V B 催化吲哚生成靛蓝的P450 BM-3定向进化的研究[期刊论文]-生物化学与生物物理 学研究进展 2005(07) 2.URLACHER V B;LUTZ-WAHL S;SCHMID R D Microbial P450 enzymes in biotechnology[外文期刊] 2004 3.URLACHER V B;SCHMID R D Protein engineering of the cytochrome P450 monooxygenase from Bacillus megaterium[外文期刊] 2004 4.GUNSTEREN W F Biomolecular simulation 1996 5.MAURER S;SCHMID R D;URLACHER V B Immobilisation of P450 BM-3 and an NADP+ cofactor recycling system:towards a technical application of heme-containing monooxygenases in fine chemical synthesis [外文期刊] 2003(6-7) 6.VANDEYAR M A;WEINER M P;HUTTON C J A simple and rapid method for the selection of oligodeoxy- nucleotide-directed mutants 1988 7.LI H;POULOS T L Fatty acid metabolism,conformational change and electron 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